呂可君

（永康市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321300）

微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性

呂可君

（永康市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321300）

目的：觀察乳腺癌組織中微淋巴管和微血管的分布情況及其與乳腺癌臨床病理特征的相關性。方法：選取60例乳腺癌患者作為病例組，按年齡匹配選取60例乳腺增生性疾病患者作為對照組。采用D2-40、CD34分別標記2組患者組織標本的微淋巴管和微血管后進行密度計數(shù)，對微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征的相關性進行分析。結果：病例組微淋巴管密度平均值為5.32±3.81，微血管密度平均值為65.34±24.18。病例組D2-40蛋白表達水平和CD34蛋白表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無關（P＞0.05），與腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移有關（P＜0.05），乳腺癌組織中微淋巴管密度與微血管密度成正相關（r=0.684，P＜0.05），微淋巴管高密度組和低密度組之間、微血管高密度組和低密度組之間患者的生存時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移密切相關，與預后無明顯相關性，與乳腺癌復發(fā)和遠處轉移密切相關。

微血管；微淋巴管；乳腺腫瘤；臨床病理特征

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，近年發(fā)病呈逐年上升趨勢，嚴重威脅患者健康和生命。隨著乳腺癌基礎與臨床研究的不斷深入，乳腺癌治療取得很大進步，但轉移和復發(fā)仍是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，也是當今乳腺癌的研究熱點。血管和淋巴管生成在癌組織的生長、浸潤和轉移擴散中起了極其重要的作用，但癌細胞如何通過微淋巴管和微血管轉移還存在爭議[1-2]。癌細胞是通過已經(jīng)存在的血管和淋巴管還是新生成的血管和淋巴管發(fā)生轉移，癌病灶內(nèi)還是癌病灶周圍的血管和淋巴管對患者的預后產(chǎn)生影響目前尚未明確[3-4]。本研究通過免疫組織化學法檢測癌組織中微淋巴管密度（D2-40標記）和微血管密度（CD34標記），探討乳腺癌組織中微淋巴管和微血管分布情況及其與臨床病理特征之間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2012年12月在本院住院治療的乳腺癌患者作為研究對象。納入標準：①病理確診為乳腺癌，所有患者均接受手術治療，術前未進行抗癌治療，預計生存期大于6個月；②患者簽署知情同意書，自愿參加，依從性較好，能接受隨訪。排除標準：①入院前接受過手術治療、抗癌治療等；②拒絕隨訪者。符合納入標準的患者共60例，年齡31～60歲，中位年齡48.6歲，平均年齡（49.2±14.2）歲。臨床分期：I期8例， II期32例，III期14例，IV期6例。按年齡匹配在本院選60例行手術治療的乳腺增生性疾病患者作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 微血管密度和微淋巴管密度檢測：采用D2-40、CD34分別標記2組患者組織標本的微淋巴管和微血管，免疫組織化學Elivision TM plus二步法[5]檢測病例組乳腺癌組織和對照組增生組織中的D2-40蛋白、CD34蛋白和微血管計數(shù)、微淋巴管計數(shù)。Elivision TM plus二步法檢測試劑購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。DAB顯色試劑購自北京中杉生物技術公司。2組患者手術標本均使用4%甲醛進行固定并脫水，使用石蠟包埋方法進行處理，然后進行切片。具體操作按照試劑盒附帶的實驗操作步驟進行。使用已知的CD34蛋白陽性切片作為陽性對照，使用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判斷：①微血管密度：采用Weidner方法計數(shù)CD34蛋白標記，即先在40倍鏡下選擇高血管密度區(qū)（熱點區(qū)）計數(shù)，然后在200倍視野下計數(shù)被染成棕黃色的血管數(shù)目。②微淋巴管密度：采用Weidner法計數(shù)D2-40蛋白標記，先在低倍鏡下尋找新生脈管最密集的區(qū)域，然后在高倍鏡下對微淋巴管進行計數(shù)，在腫瘤組織內(nèi)以5個高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示微淋巴管密度。

1.2.3 隨訪：由經(jīng)過培訓的隨訪員通過電話、定期回院復查等途徑進行隨訪，以患者手術日為隨訪起點，每位患者隨訪3年，隨訪截止時間為2015年12月31日。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，微淋巴管密度與微血管密度的關系采用pearson相關性分析。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 D2-40標記的微淋巴管密度及CD34標記的微血管密度 D2-40標記的淋巴管呈一致性的管腔結構，染色呈棕黃色，表現(xiàn)為一層薄壁，管腔內(nèi)很少有淋巴細胞，無紅細胞（見圖1A）。D2-40標記的微淋巴管密度平均值為5.32±3.81，中位數(shù)為4.1，以中位數(shù)為分界值，將微淋巴管密度≥4.1定義為高密度組，＜4.1為低密度組，其中高密度組34例，低密度組26例。CD34標記的微血管可見染色清晰的血管內(nèi)皮細胞，呈棕黃色至深褐色彌散性分布，管腔大小不一（見圖1B）。CD34標記的微血管密度平均值為65.34±24.18，中位數(shù)為58.74，以中位數(shù)為分界值，將微血管密度≥58.74定義為高密度組，＜58.74的為低密度組，其中高密度組32例，低密度組28例。對照組D2-40標記的淋巴管很少，未見棕黃色染色；CD34標記的微血管也較少，基本沒有棕黃色或褐色染色。

圖1 免疫組織化學染色結果

2.2 2組D2-40和CD34蛋白表達水平的比較 病例組患者乳腺癌組織中D2-40蛋白表達水平和CD34蛋白表達水平明顯高于對照組增生組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征的關系 微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無關（P＞0.05），與患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表2。

2.4 微淋巴管密度與微血管密度的關系 Pearson相關性分析顯示，乳腺癌組織中微淋巴管密度與微血管密度成正相關（r=0.684，P=0.011）。

2.5 微淋巴管密度和微血管密度與預后的關系 微淋巴管高密度組和低密度組之間、微血管高密度組和低密度組之間乳腺癌患者的生存時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表1 2組D2-40和CD34蛋白表達水平比較（）

表1 2組D2-40和CD34蛋白表達水平比較（）

與對照組比：aP＜0.05

組別 例數(shù) D2-40 CD34對照組 60 2.11±0.82 16.84± 4.83病例組 60 5.32±3.81a65.34±24.18a

表2 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征關系（）

表2 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征關系（）

項目 例數(shù) 微淋巴管密度 t/F P 微血管密度 t/F P年齡（歲） 0.293 0.769 0.229 0.819＜35 16 5.12±3.64 63.17±24.86≥35 44 5.43±3.58 64.82±24.21腫瘤直徑（cm） 2.312 0.014 3.125 0.004≤2 21 4.48±2.86 61.82±26.44＞2 39 6.68±2.92 65.97±27.28臨床分期 3.867 0.008 2.889 0.012 I 8 3.74±2.63 62.36±21.87 II 14 5.83±2.26 63.98±24.63 IV 6 6.49±2.66 62.17±22.41淋巴結轉移 4.027 ＜0.001 2.036 0.042有25 5.86±2.12 68.79±26.33無35 3.62±2.13 55.12±24.63 32 5.22±2.18 63.84±23.47 III

表3 微淋巴管密度和微血管密度與預后的關系（）

表3 微淋巴管密度和微血管密度與預后的關系（）

項目 例數(shù) 生存時間（月） t P微淋巴管密度 0.337 0.736低密度 26 36.2±2.4高密度 34 36.4±2.1微血管密度 0.920 0.358低密度 28 36.2±2.7高密度 32 36.8±2.3

3 討論

目前乳腺癌治療采用以手術切除為主的綜合治療，隨著早期篩查的開展和診斷技術的提高，其治療效果得到明顯提升，患者生存期得以延長，但腫瘤的復發(fā)轉移仍是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。經(jīng)淋巴管和血管轉移是乳腺癌轉移最常見的途徑，乳腺癌細胞遠處轉移不僅影響乳腺癌的臨床分期、治療方案的選擇，而且對治療效果及預后有極其重要的預測作用[6]。因此，對淋巴管、血管轉移的相關因素如微淋巴管及微血管生成的研究已經(jīng)成為近年研究的熱點。新生微淋巴管和微血管在乳腺癌浸潤、轉移、復發(fā)等過程中發(fā)揮重要的作用，通過檢測微淋巴管密度和微血管密度可以直接了解腫瘤組織中的微淋巴管和微血管新生的活躍程度[7-8]。D2-40是一種淋巴管內(nèi)皮特異性較高的淋巴管標記物，并且較HE染色方法能更敏感和特異地檢測出腫瘤的微淋巴管浸潤[9]。CD34是表達于正常內(nèi)皮細胞表面的跨膜糖蛋白，是常用的血管內(nèi)皮細胞標記物，其特異性及敏感性均高于CD31、V III因子的血管內(nèi)皮細胞標志物，能特異性顯示腫瘤的新生微血管，現(xiàn)已成為研究微血管的成熟標志物[10]。本研究通過D2-40、CD34標記乳腺癌患者腫瘤組織中的微淋巴管和微血管，該方法具有成熟、準確可靠等優(yōu)點。

本研究結果顯示，病例組患者乳腺癌組織D2-40蛋白表達水平和CD34蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），說明乳腺癌組織中微淋巴管密度、微血管密度高于乳腺增生組織，提示微淋巴管和微血管在乳腺癌組織發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，研究結果與文獻報道[11-12]相一致。主要原因分析：乳腺癌組織分泌一些刺激血管及淋巴管生長的因子，刺激乳腺癌組織的微血管和微淋巴管生成，以滿足乳腺癌組織的營養(yǎng)供給，促進乳腺癌組織的生長。魏曉龍等[13]研究報道，乳腺癌患者微血管密度與乳腺癌的大小和淋巴結轉移成正相關，而與乳腺癌患者年齡、組織學分級等無關。沈葉等[14]研究報道，乳腺癌患者微血管密度與乳腺癌TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度、侵襲力等有關。本研究結果顯示，微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無關（P＞0.05），與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移有關（P＜0.05），與上述文獻報道相一致，進一步證實了微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系。主要原因分析：腫瘤能迅速生長取決于腫瘤組織血管、淋巴管的營養(yǎng)供應，腫瘤直徑大，癌組織需要的營養(yǎng)供應多，刺激了微淋巴管密度和微血管密度增高，以滿足營養(yǎng)的運輸。不同的臨床分期說明了腫瘤的惡性程度，惡性程度越高說明腫瘤組織生長越活躍，需要營養(yǎng)供應越多，在各種因子刺激下微淋巴管和微血管形成更多。癌細胞主要通過淋巴管發(fā)生轉移，癌組織發(fā)生轉移，說明癌組織生長迅速，需要更多的淋巴管和血管參與。微淋巴管密度和微血管密度與預后生存期無關，可能是乳腺癌患者生存期隨著診療技術水平的提高已有顯著提高，在較短的隨訪時間內(nèi)，高低密度組患者生存可能無顯著差異[15-16]，應繼續(xù)延長隨訪時間。

綜上所述，微淋巴管密度和微血管密度與與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移密切相關，與預后無明顯相關性。研究乳腺癌組織血管及淋巴管生成，有助于了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉移機制，為以乳腺癌血管或淋巴管作為靶點的抗乳腺癌治療提供理論基礎，通過抑制和阻斷血管及淋巴管生成途徑，控制乳腺癌轉移復發(fā)。

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（本文編輯：趙翠翠）

Relationship between microvascular density, micro lymphatic vessel density and clinicopathological char-acteristics of breast cancer

LYU Kejun. Department of Pathology, the First People’s Hospital of Yongkang,

Jinhua, 321300

Objective: To detect the expressions of microvascular density (MVD) and micro lymphatic vessel density (LVD) in breast cancer tissues, investgate the relationship between MVD, LVD and clinical pathological features of breast cancer. Methods: A total of 60 cases of breast cancer patients were selected as the patients group, and 60 cases of proliferative diseases of mammary gland patients were selected as the control group. By adopting D2-40 marker of lymphatic endothelial cells and CD34 marker of vascular endothelial cells, breast cancer MVD and LVD were counted separately under a microscope. The relationship between expressions of MVD, LVD and clinical pathological features also were analyzed the relationship between expressions of MVD, LVD of breast cancer patients. Results: In the patients group, the average value of LVD was (5.32±3.81), and the average MVD was (65.34±24.18). The protein expression level of D2-40 and CD34 in the patients group was signi fi cantly higher than that of the control group (P＜0.05), there is no correction of patients’ age with LVD and MVD (P＞0.05), there was correction of tumor size, clinical stage, lymph node metastasis with LVD and MVD (P＜0.05), and MVD and LVD were positively correlated (r=0.684, P＜0.05). There was no signi fi cant difference in survival time between higher LVD group and lower LVD group, higher MVD group and lower MVD group (P＞0.05). Conclusion: LVD and MVD are closely related with tumor diameter, clinical stage and lymph node metastasis in breast cancer patients, and no signi fi cant correlation with prognosis, which was closely related to breast cancer recurrence and distant metastasis.

microvessel; micro lymphatic vessel; breast neoplasms; clinical pathological characteristics

R737.9

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.014

2016-07-20

呂可君（1977-），女，浙江永康人，主治醫(yī)師。