周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

?論 著?

TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及其與miR-let-7a靶向關(guān)系的驗(yàn)證

周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

目的：構(gòu)建 III型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（TGFβR3）基因3’非編碼區(qū)（3’UTR）雙熒光素酶報(bào)告載體，并分析其與miR-let-7a的靶向關(guān)系。方法：根據(jù)microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件targetscan獲取miR-let-7a與TGFβR3基因3’UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T載體，定點(diǎn)突變潛在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)后雙酶切pGEM-T載體獲取目的片段并插入至雙熒光素酶報(bào)告載體獲得野生型和突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體，測(cè)序鑒定；將2種載體分別與miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)各組熒光素酶活性。結(jié)果：經(jīng)測(cè)序鑒定成功構(gòu)建野生型和突變型重組熒光素酶報(bào)告載體。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)顯示，共轉(zhuǎn)染miR-let-7a mimics和野生型雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光素酶活性比miR-let-7a NC組明顯降低（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染突變型雙熒光素酶報(bào)告載體后其熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，并證實(shí)TGFβR3基因是新發(fā)現(xiàn)的miR-let-7a直接靶向調(diào)控基因。

mioroRNAs；miR-let-7a； III型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體；雙熒光素酶報(bào)告載體

microRNA let-7a（miR-let-7a）是最早發(fā)現(xiàn)以及目前研究最廣泛的microRNA之一，它通過(guò)與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）特異性結(jié)合，從而降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯過(guò)程[1]。miR-let-7a在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[2-4]，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤[5]、炎癥[6]、心血管[7]等人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展。尤其在腫瘤中，miR-let-7a被證實(shí)具有抑癌作用[8]，并在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種疾病中處于低表達(dá)狀態(tài)[9-10]。根據(jù)microRNA的作用機(jī)理，本研究經(jīng)microRNA靶基因預(yù)測(cè)工具篩選分析發(fā)現(xiàn)， III型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（transforming growth factor beta receptor 3，TGFβR3）是miR-let-7a直接靶向調(diào)控的潛在靶基因之一，而TGFβR3是TGF-β受體的一種亞型，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[11]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證TGFβR3基因是否為miR-let-7a的靶向調(diào)控基因，為進(jìn)一步研究miR-let-7a的抑癌作用提供分子機(jī)制基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 人腎胚293T（HEK293T）細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。pGEM-T載體、雙熒光素酶報(bào)告載體（pmirGLO載體）均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。限制性?xún)?nèi)切酶PmeI和SalI、DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，PCR試劑盒、大腸桿菌菌株DH5α、質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，DL10003購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000、SYBR Green PCR Master Mix、胰蛋白酶、DMEM、Trizol、Opti-MEM medium等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-let-7a mimics和陰性對(duì)照（miR-let-7a NC）購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)：通過(guò)microRNA靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件targetscan獲取miR-let-7a與TGFβR3基因3’UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，再?gòu)腉eneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得TGFβR3基因3’UTR序列（基因號(hào)NM_003243.4），利用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含TGFβR3基因3’UTR上miR-let-7a預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的正向引物和反向引物，并在正向引物5’端加上限制性?xún)?nèi)切酶PmeI及其保護(hù)堿基，反向引物加上限制性?xún)?nèi)切酶SalI及其保護(hù)堿基。根據(jù)定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)用于miR-let-7a潛在結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變的突變引物。具體引物序列見(jiàn)表1，其中下劃線(xiàn)分別表示PmeI、SalI酶切位點(diǎn)，AGCTTT、GC代表保護(hù)堿基。

表1 引物序列

1.2.2 TGFβR3基因3’UTR序列的擴(kuò)增：嚴(yán)格按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提人基因組DNA，再以人基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增人TGFβR3基因3’UTR序列。PCR反應(yīng)步驟：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s循環(huán)30次后，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行切膠回收純化。

1.2.3 pGEM-T載體的構(gòu)建：將pGEM-T載體和切膠回收純化的PCR產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，4 ℃連接過(guò)夜，經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后構(gòu)建易于突變反應(yīng)的野生型pGEMT-TGFβR3 3’UTR載體（命名為pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT）。然后用點(diǎn)突變引物按定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行點(diǎn)突變PCR反應(yīng)構(gòu)建出突變型pGEMT-TGFβR3 3’UTR載體（命名為pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT）。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建和鑒定：將pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT或pGEMT-TGFβR3 3’UTR-MUT載體和pmirGLO載體分別用限制性?xún)?nèi)切酶PmeI和SalI在37 ℃水浴鍋中進(jìn)行雙酶切過(guò)夜。將酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行切膠回收純化，將純化的pmirGLO載體和TGFβR3 3’UTR-WT/MUT片段分別在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，4 ℃連接過(guò)夜。再經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增得到野生型和突變型重組pmir-GLO載體，分別命名為pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT和pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT。取1 μL擴(kuò)增后的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，最后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞：將HEK293T細(xì)胞接種于24孔板，在37 ℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC分別與重組pmirGLO載體（pmirGLOTGFβR3 3’UTR-WT或pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，分別記為miR-let-7a mimics組和miR-let-7a NC組，轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 雙熒光素酶活性測(cè)定：將共轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100 μL的1×PLB到24孔培養(yǎng)板中，室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15 min，將裂解液轉(zhuǎn)移到EP管中。從EP管中轉(zhuǎn)移20 μL裂解液到檢測(cè)管中，再加入100 μL LAR II，混合后檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性；接著向檢測(cè)管中加入100 μL Stop&Glo試劑，檢測(cè)海腎熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGFβR3與let-7a靶向關(guān)系預(yù)測(cè) 采用生物信息分析工具targetscan等預(yù)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)TGFβR3基因的3’UTR第2 994～第3 001位堿基存在miR-let-7a的潛在結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)圖1），并且預(yù)測(cè)評(píng)分百分比高達(dá)94%，miR-let-7a具有很大的概率靶向調(diào)控TGFβR3基因。因此，選取TGFβR3作為本研究的目的基因。

圖1 TGFβR3 3’UTR上miR-let-7a的潛在結(jié)合位點(diǎn)

2.2 pGEM-T載體的構(gòu)建 通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因TGFβR3 3’UTR片段，片段大小1 229 bp（見(jiàn)圖2A），將目的片段插入易于突變實(shí)驗(yàn)的pGEM-T載體（pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT），將pGEMT-TGFβR3 3’UTRWT進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得突變型pGEM-T載體（pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT）。對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后可見(jiàn)明亮的單一條帶，插入TGFβR3 3’UTR片段大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致（見(jiàn)圖2B）。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建和鑒定 將易于點(diǎn)突變反應(yīng)的載體pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT和pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)獲取目的片段，片段大小1 229 bp（見(jiàn)圖3A），膠回收后插入雙熒光素酶報(bào)告載體。對(duì)重組雙熒光素酶報(bào)告載體（pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT和pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT）進(jìn)行測(cè)序鑒定，經(jīng)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT中miR-let-7a的潛在結(jié)合位點(diǎn)上下游序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列完全一致，并且重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT中的miR-let-7a潛在結(jié)合位點(diǎn)CTACCTCA成功突變?yōu)镃TGC GGCA（見(jiàn)圖3B），成功構(gòu)建野生型和突變型TGFβR3 3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段TGFβR3 3’UTR

圖3 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建和鑒定

2.4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性的表達(dá) 通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)顯示，相比于miR-let-7a NC組，miR-let-7a mimics和野生型重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT共轉(zhuǎn)染后的螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值出現(xiàn)較明顯的下降；而在TGFβR3 3’UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變之后，共轉(zhuǎn)染突變型重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTRMUT后，miR-let-7a mimics組和miR-let-7a NC組的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值差異卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。這說(shuō)明TGFβR3 3’UTR存在miR-let-7a的結(jié)合位點(diǎn)，并且miR-let-7a特異性作用于這一結(jié)合位點(diǎn)，抑制TGFβR3基因的表達(dá)。

表2 轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（n=3）

表2 轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（n=3）

pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT miR-let-7a NC組 1.00±0.02 1.00±0.07 miR-let-7a mimics組 0.67±0.05 1.01±0.06 t 11.390 0.428 P 0.008 0.691組別 pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT

3 討論

miR-let-7a是最早發(fā)現(xiàn)，也是目前研究最廣泛的microRNA之一[12]。過(guò)去大量研究表明，miR-let-7a在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量通常是下調(diào)的，提示miR-let-7a的功能抑制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。microRNA的作用機(jī)理是通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR特異性結(jié)合，從而降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯過(guò)程[1]。3’UTR是mRNA的3’端非編碼區(qū)，存在不同microRNA的特定結(jié)合位點(diǎn)，并且對(duì)mRNA的翻譯以及穩(wěn)定性具有重要作用[15]。因而，尋找miR-let-7a直接靶向調(diào)控的靶基因是研究其對(duì)腫瘤的作用機(jī)制的關(guān)鍵之一。在143例肺癌標(biāo)本分析中發(fā)現(xiàn)miR-let-7a家族的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-let-7a抑制了細(xì)胞增殖能力[9]，并且RAS和HMGA2是miR-let-7a直接靶向調(diào)控的靶基因[16-17]。另外，miR-let-7a通過(guò)靶向調(diào)控HMGA2抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力[2]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力[18]。在前列腺癌中，miR-let-7a通過(guò)靶向下調(diào)IGF1R抑制腫瘤細(xì)胞增殖并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。在45例生殖細(xì)胞腫瘤芯片中，MURRAY等[20]發(fā)現(xiàn)17例睪丸惡性生殖細(xì)胞腫瘤中miR-let-7家族（含miR-let-7a）的表達(dá)均出現(xiàn)顯著下降，并且后續(xù)在睪丸胚胎癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)上調(diào)miR-let-7e的表達(dá)量，能夠降低促癌蛋白AURKB、LIN28、MYCN等的水平。這些研究都表明miR-let-7a通過(guò)直接靶向調(diào)控靶基因在抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

通過(guò)生物信息學(xué)分析，miR-let-7a還存在大量未發(fā)現(xiàn)的靶基因。在本研究中，我們利用microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件targetscan分析發(fā)現(xiàn)，miR-let-7a可以特異性結(jié)合TGFβR3基因的3’UTR，其結(jié)合位點(diǎn)在3’UTR的第2 994～第3 001位堿基CUACCUCA。而TGFβR3是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的一種蛋白多糖，是TGFβ的受體之一[21]。TGFβR3通過(guò)結(jié)合TGFβR1和TGFβR2使其同型受體更易與配體相結(jié)合，從而協(xié)同激活下游SMAD信號(hào)通路[22-23]。有研究表明，TGFβR3的表達(dá)及TGFβ/SMAD信號(hào)通路與癌癥的關(guān)系非常密切，并在多種不同的腫瘤模型中均有調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖以及血管生成的作用，可調(diào)控多種腫瘤的進(jìn)程[24-25]。并且在體外乳腺癌細(xì)胞和體內(nèi)裸鼠乳腺癌移植模型中，TGFβR3均可以抑制腫瘤血管生成，并且能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)[26-27]。我們通過(guò)構(gòu)建TGFβR3 3’UTR重組雙熒光素酶報(bào)告載體，并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-let-7a與TGFβR3基因之間具有靶向調(diào)控關(guān)系，且證實(shí)miR-let-7a特異性作用于TGFβR3基因的3’UTR位置的第2 994～第3 001序列堿基，對(duì)TGFβR3基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。因而我們推測(cè)miR-let-7a可能通過(guò)靶向調(diào)控TGFβR3基因，并且可能通過(guò)TGFβ/SMAD信號(hào)通路傳導(dǎo)信息，從而達(dá)到腫瘤抑制作用。這一研究結(jié)果有利于我們進(jìn)一步研究腫瘤的調(diào)控機(jī)制，為研究miR-let-7a抑制腫瘤的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)，并且在應(yīng)用miR-let-7a對(duì)腫瘤進(jìn)行分子治療時(shí)提供有效幫助。

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（本文編輯：賈建敏）

Construction of TGFβR3 gene 3’UTR dual luciferase reporter vector and targeting veri fi cation between

TGFβR3 and miR-let-7a ZHOU Huandong, GU Rui, WU Dazhou, CHEN Xiaoming. Department of Pediatric Surgery, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To construct a luciferase reporter vector containing the 3’untranslated region (3’UTR) of TGFβR3 gene and evaluate the targeting correlation between TGFβR3 and miR-let-7a. Methods: The potential complementary binding sites of miR-let-7a and TGFβR3 were predicted by targetscan. The 3’UTR fragment of TGFβR3 ampli fi ed by PCR was fi rstly cloned into pGEM-T vector and the potential complementary binding sites was mutated. Then, the ampli fi ed fragment and the mutated fragment of TGFβR3 3’UTR were subcloned into pmirGLO dual-luciferase miRNA target expression vector within the PmeI/SalI restriction sites. The luciferase reporter vector and miR-let-7a mimics/miR-let-7a NC were co-transfected into HEK293T cells respectively. The relative luciferase activity was detected by luciferase reporter assay. Results: Results of double enzyme digestion and DNA sequencing con fi rmed that the luciferase reporter vector was successfully constructed. The relative luciferase activity of TGFβR3 3’UTR reporter vector and miR-let-7a mimics co-transfected group were decreased signi fi cantly comparing with miR-let-7a NC group (P＜0.05), but the relative luciferase activity was no signi fi cance in TGFβR3 3’UTR mutated reporter vector. Conclusion: The luciferase reporter vector containing the 3’UTR-WT or 3’UTR-MUT of TGFβR3 is constructed successfully. And TGFβR3 is a direct novel target gene of miR-let-7a.

microRNAs; miR-let-7a; transforming growth factor beta receptor 3; luciferase reporter vector

R73

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.001

2016-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81673643）；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2012C23066）。

周歡棟（1990-），男，浙江諸暨人，碩士生。

陳肖鳴，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：cxm@ wmu.edu.cn。