石玥 穆國(guó)華 吳麗婷 申萌萌 趙青竹 劉雁峰

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二補(bǔ)助育改良方對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突、LIF、ER和PR表達(dá)的影響

石玥 穆國(guó)華 吳麗婷 申萌萌 趙青竹 劉雁峰

目的 觀察二補(bǔ)助育改良方對(duì)胚泡著床障礙模型小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達(dá)的影響。 方法 建立小鼠胚泡著床障礙模型，將50只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組：空白組、模型組、西藥組1(補(bǔ)佳樂(lè)組)、西藥組2(阿司匹林組)、二補(bǔ)助育改良方組，每組10只。造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，其后處死小鼠，掃描電鏡觀察胞飲突的表達(dá)，并采用免疫組化HBP法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜LIF、ER、PR的表達(dá)量。 結(jié)果 掃描電鏡下，二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜表面形態(tài)較規(guī)整，大量微絨毛及豐富胞飲突表達(dá)，細(xì)胞之間的間隙明顯。免疫組化結(jié)果示，二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜LIF、ER、PR表達(dá)較模型組明顯增加(P<0.05)；LIF表達(dá)低于補(bǔ)佳樂(lè)組(P<0.05)，ER表達(dá)優(yōu)于補(bǔ)佳樂(lè)組(P<0.05)，PR表達(dá)與補(bǔ)佳樂(lè)組無(wú)明顯差異(P>0.05)；各指標(biāo)與阿司匹林組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論 二補(bǔ)助育改良方可能通過(guò)調(diào)節(jié)胚泡著床期子宮內(nèi)膜胞飲突、LIF、ER和PR的表達(dá)，從而提高子宮內(nèi)膜容受性，參與胚泡植入的黏附過(guò)程，改善著床障礙，創(chuàng)造良好的受孕環(huán)境，促進(jìn)胚泡著床。

二補(bǔ)助育改良方； 子宮內(nèi)膜容受性； 胞飲突； 白血病抑制因子； 雌激素受體； 孕激素受體

子宮內(nèi)膜容受性，是指內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，與體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的成功與否密切相關(guān)。近年來(lái)，中醫(yī)藥提高子宮內(nèi)膜容受性的療效逐漸得到肯定。二補(bǔ)助育湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院首席教授、名老中醫(yī)肖承悰教授調(diào)治子宮內(nèi)膜容受性低的經(jīng)驗(yàn)方。在前期研究中[1-3]，已對(duì)全方進(jìn)行了相應(yīng)的臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究，取得較好的研究結(jié)果，結(jié)果表明其能明顯改善子宮內(nèi)膜容受性。

方名中“二補(bǔ)”，是指原方以補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)為君藥。鑒于目前對(duì)補(bǔ)骨脂的肝腎毒性存在爭(zhēng)議，臨床使用時(shí)，已將補(bǔ)骨脂去除以改良此方，故本課題選用二補(bǔ)助育改良方(去補(bǔ)骨脂，下稱(chēng)改良方)進(jìn)一步研究。子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控機(jī)制需要諸多因素的參與。其中，胞飲突，作為形態(tài)學(xué)指標(biāo)，被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)目前被認(rèn)為是種植著床預(yù)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)；雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系已經(jīng)明確。故選用目前公認(rèn)的、可視為標(biāo)志性、影響子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)——胞飲突、LIF、ER、PR，以期探討二補(bǔ)助育改良方對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，并闡明其對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥提高子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)ICR小鼠，8～12周齡，體質(zhì)量(25±2) g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。對(duì)小鼠進(jìn)行陰道涂片，檢查動(dòng)情周期，連續(xù)觀察2個(gè)動(dòng)情周期正常者。

1.2 主要藥物

1.2.1 二補(bǔ)助育改良方 藥物組成：骨碎補(bǔ)15 g、巴戟天15 g、桑寄生15 g、續(xù)斷15 g、川牛膝15 g、雞血藤15 g、郁金15 g。顆粒制劑購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院門(mén)診藥房。

1.2.2 達(dá)必佳(醋酸曲普瑞林注射液) 規(guī)格1 mL∶0.1 mg，輝凌(德國(guó))制藥有限公司，進(jìn)口藥品批號(hào)H20100365；注射用尿促性素，規(guī)格：75單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033108；注射用絨促性素，規(guī)格：1000單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H44020674。以上均購(gòu)自北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥房。

1.2.3 補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇) 規(guī)格1 mg/片，DELPHARM Lille S.A.S.制藥，進(jìn)口藥品批號(hào)：H20120368；阿司匹林腸溶片，規(guī)格100 mg/片，BayerS.p.A.制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130078。以上均購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院藥房。

1.3 主要試劑與儀器

抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako Denmark A/S生產(chǎn)，貨號(hào)K5007；攝像機(jī)PANASONIC型號(hào)MV-CP410,顯微鏡Olympus BH2；組化分析軟件IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，上海申騰信息技術(shù)有限公司。

ER(稀釋比1∶300;貨號(hào)ab32063;生產(chǎn)商Abcam,Cambridge,MA,USA)；PR (稀釋比1∶100;貨號(hào)ab63605;生產(chǎn)商Abcam,Cambridge,MA,USA)； LIF (稀釋比1∶100;貨號(hào)NBP2-27406;生產(chǎn)商N(yùn)ovus)。

1.4 方法

1.4.1 分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為5組，分別為：空白組、模型組、西藥組1(補(bǔ)佳樂(lè)組)、西藥組2(阿司匹林組)、二補(bǔ)助育改良方組，每組10只。

1.4.2 動(dòng)物模型的建立 采用GnRHa+HMG+HCG方案。造模方法：觀察除空白組外的小鼠陰道涂片，從動(dòng)情日開(kāi)始，每日于上午9:00定時(shí)腹腔內(nèi)注射達(dá)必佳40 IU/100 g體質(zhì)量，連續(xù)9天，至第9天同時(shí)注射尿促性素1 U/100 g體質(zhì)量促排卵，48小時(shí)后注射人絨毛膜促性腺激素10 IU/100 g體質(zhì)量，造成胚泡著床障礙模型。

1.4.3 給藥方法 于造模同時(shí)，空白組和模型組每日灌服生理鹽水0.2 mL，二補(bǔ)助育改良方組每日按0.349 g/20 g的濃度灌服(相當(dāng)于臨床體重60 kg的成人劑量140 g/60 kg。西藥組1每日灌服補(bǔ)佳樂(lè)0.006 mg/20 g(相當(dāng)于臨床體重60 kg的成人劑量2 mg/60 kg)，西藥組2每日灌服阿司匹林0.225 mg/20 g(相當(dāng)于臨床體重60 kg的成人劑量75 mg/60 kg)，連續(xù)10天。

1.4.4 取材檢測(cè) 于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第11天，斷頸處死小鼠，無(wú)菌條件下取全子宮，將其中一角子宮取0.5 cm長(zhǎng)的管徑，縱向剖開(kāi)，磷酸鹽PBS緩沖液充分洗滌后投入戊二醇中固定，選擇內(nèi)膜面平整容易觀察的部位，備掃描電鏡觀察胞飲突表達(dá)；另一角子宮立即放在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。采用免疫組化HRP法測(cè)定小鼠子宮內(nèi)膜LIF、ER、PR的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察胞飲突在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)

空白組小鼠子宮內(nèi)膜表面形態(tài)較規(guī)整，呈現(xiàn)胞飲突豐富表達(dá)，上皮細(xì)胞分布均勾，形態(tài)大小基本一致，之間界限清楚。模型組內(nèi)膜局部有少量胞飲突表達(dá)，形態(tài)大小不一，微絨毛不明顯，細(xì)胞間分界不清。西藥組小鼠子宮內(nèi)膜表面細(xì)胞形態(tài)不均一性，片狀，褶皺，不飽滿(mǎn)，胞飲突發(fā)育低小，可見(jiàn)微絨毛，細(xì)胞界限欠清。改良方組小鼠子宮內(nèi)膜表面形態(tài)較規(guī)整，細(xì)胞表面有大量微絨毛及豐富的胞飲突，突起更明顯，細(xì)胞之間的間隙明顯，有利于細(xì)胞黏附。見(jiàn)下圖1。

2.2 LIF、ER及PR在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)比較

免疫組織化學(xué)分析，LIF在各組子宮內(nèi)膜組織都有表達(dá)，組織定位表達(dá)的部位主要在腔上皮和腺上皮。與空白組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)明顯增加(P<0.05)；二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)與阿司匹林組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，卻明顯低于補(bǔ)佳樂(lè)組(P<0.05)，補(bǔ)佳樂(lè)組與阿司匹林組無(wú)明顯差異(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、表1。

免疫組織化學(xué)分析，ER、PR在各組小鼠子宮內(nèi)膜的腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。與空白組相比，模型組小鼠子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)明顯增加(P<0.05)；二補(bǔ)助育改良方組小鼠子宮內(nèi)膜ER表達(dá)明顯高于補(bǔ)佳樂(lè)組(P<0.05)，但PR表達(dá)與補(bǔ)佳樂(lè)組無(wú)明顯差異(P>0.05)，ER、PR表達(dá)與阿司匹林組無(wú)明顯差異(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4、表1。

圖1 掃描電鏡觀察胞飲突在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)(×3000)

圖2 顯微鏡觀察到LIF在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況(×200)

圖3 顯微鏡觀察到ER在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況(×200)

圖4 顯微鏡觀察到PR在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況(×200)

表1 各組小鼠子宮內(nèi)膜LIF、ER、PR表達(dá)情況

注：與空白組比較，aP<0.05，與模型組比較，bP<0.05，與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，cP<0.05，與阿司匹林組比較，dP>0.05。由于灌胃操作不當(dāng)，模型組死亡1只，阿司匹林組死亡1只，二補(bǔ)助育改良組方死亡2只。

3 討論

3.1 胞飲突與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞由纖毛細(xì)胞和微絨毛細(xì)胞組成。在月經(jīng)周期黃體期子宮內(nèi)膜上皮微絨毛細(xì)胞頂部出現(xiàn)平滑的膜狀突起，微絨毛完全消失，形狀如蘑菇，稱(chēng)之為胞飲突。胞飲突分3個(gè)階段:發(fā)育中、發(fā)育完全、退化，其表達(dá)數(shù)量與胚胎種植率的關(guān)系緊密,主要在分泌中、晚期的子宮內(nèi)膜表面出現(xiàn)，2天內(nèi)發(fā)育完全和退化，出現(xiàn)時(shí)間個(gè)體差異可達(dá)5天,與著床窗出現(xiàn)的時(shí)間基本一致，被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜著床窗開(kāi)放的超微結(jié)構(gòu)標(biāo)志。血供不足的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)胞飲突低表達(dá)，子宮內(nèi)膜容受性降低，可能是導(dǎo)致著床失敗的原因之一[4]。

3.2 LIF與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

LIF的表達(dá)在人、鋸齒類(lèi)動(dòng)物子宮內(nèi)膜上呈周期性變化。卵泡期LIF表達(dá)低下,黃體中期達(dá)高峰。LIF及其受體的表達(dá)水平與胞飲突相一致,著床期宮腔沖洗液中LIF的濃度與妊娠率呈正相關(guān)[5]。近年來(lái)LIF在胚胎著床、妊娠維持和胚胎發(fā)育中的作用越發(fā)引起海內(nèi)外學(xué)者的重視[6-7]。資料表明LIF在月經(jīng)周期的第19～24天,即胚胎著床期呈高水平表達(dá)[8],基因敲除實(shí)驗(yàn)也證明LIF是胚胎著床的必要因子。部分不明原因不孕者、反復(fù)自然流產(chǎn)者子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)下降,這些都提示LIF可能參與胚胎著床。Mitchel等[8]發(fā)現(xiàn)LIF可提高胚胎的發(fā)育率、著床率、妊娠率。Sherwin等[9]也證實(shí)了 LIF的作用位點(diǎn)及與胚胎的作用。因此猜測(cè)LIF可能在人類(lèi)生殖活動(dòng)中扮演關(guān)鍵角色[10-11]。

3.3 ER、PR與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

雌、孕激素可通過(guò)ER、PR對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行調(diào)節(jié)，在月經(jīng)周期的第19天，子宮內(nèi)膜腺上皮的ER、PR突然消失，并且其降調(diào)與胞飲突同時(shí)發(fā)生[12]。適當(dāng)濃度的孕酮水平和子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)，是子宮內(nèi)膜蛻膜化的必備條件。研究發(fā)現(xiàn)[13]，封閉PR抗體或敲除PR基因，將阻斷孕酮的效應(yīng)，使子宮內(nèi)膜不能順利蛻膜化，導(dǎo)致胚泡難以著床。據(jù)研究表明[14]，受卵巢甾體激素(E2/P)的調(diào)節(jié)，雌、孕激素與其受體結(jié)合啟動(dòng)下游分子的合成，是子宮內(nèi)膜容受性形成的主要原因，是故ER、PR被認(rèn)為是評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志之一。

3.4 西藥對(duì)照組

肖承悰教授認(rèn)為，子宮內(nèi)膜容受性低的主要病機(jī)為腎氣不足，胞脈不暢，故以“腎主生殖”為主要理論基礎(chǔ)，以“補(bǔ)腎氣、通胞脈”為治法[15]，從整體上調(diào)節(jié)腎—天癸—沖任—胞宮生殖軸，在局部又促進(jìn)胞脈與胞宮以及其他臟腑經(jīng)絡(luò)之間的聯(lián)系，改善子宮內(nèi)膜血循環(huán)，從而促進(jìn)胚胎著床及發(fā)育。

補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇)是雌激素家族中的一種，其作用機(jī)理可能是通過(guò)間接促進(jìn)子宮內(nèi)膜胞飲突的形成，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，建立子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)，從而改善胚胎著床障礙。許多補(bǔ)腎中藥的雌激素樣作用已經(jīng)獲得普遍認(rèn)同[16-17]，本課題選用補(bǔ)佳樂(lè)側(cè)重于補(bǔ)腎作用的對(duì)照。

阿司匹林作為乙酰水楊酸類(lèi)藥物，具有血管舒張功能和抗凝劑的性質(zhì)，是其作為IVF-ET輔助用藥的原因。機(jī)制為通過(guò)抑制環(huán)氧合酶而抑制血小板活性，預(yù)防微血栓形成，降低子宮動(dòng)脈血流阻力，改善局部血循環(huán)，卵巢和子宮內(nèi)膜的血流灌注，從而改善子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，提高胚胎植入率或妊娠率。本課題選用阿司匹林側(cè)重于“通胞脈”作用的對(duì)照。

3.5 二補(bǔ)助育改良方與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

前期工作是針對(duì)二補(bǔ)助育湯原方展開(kāi)。筆者觀察了肖教授治療子宮內(nèi)膜容受性低患者120例，對(duì)其中42例進(jìn)行了隨訪，再次IVF-ET受孕率為57.1%。另外，二補(bǔ)助育湯可以顯著改善子宮內(nèi)膜容受性低患者的癥狀，同時(shí)增加子宮內(nèi)膜厚度，并提高雌激素水平，臨床效果顯著[2]。實(shí)驗(yàn)方面，二補(bǔ)助育湯可能通過(guò)干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)等調(diào)控因子參與胚胎植入的黏附過(guò)程，從而影響子宮內(nèi)膜容受性[3]。本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置梯度，前期工作證實(shí)[3]，高、中劑量均可改善子宮內(nèi)膜容受性，故取前期工作全方的中劑量為參照，既保證療效，又盡可能減少藥物干預(yù)。

原方以補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)為君藥，鑒于目前對(duì)補(bǔ)骨脂的腎毒性存在爭(zhēng)議，肖教授在臨床上多已棄用，故選用二補(bǔ)助育改良方(去補(bǔ)骨脂)進(jìn)一步研究。改良方承于原方，“補(bǔ)(補(bǔ)腎氣)、通(通胞脈)并用”之則未改，補(bǔ)腎氣的同時(shí)注重通胞脈。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二補(bǔ)助育改良方能明顯促進(jìn)胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育，以及明顯提高LIF、ER、PR的表達(dá)，并基本持平甚或優(yōu)于西藥組。筆者認(rèn)為，二補(bǔ)助育改良方可能通過(guò)調(diào)節(jié)胚泡著床期子宮內(nèi)膜胞飲突、LIF、ER和PR的表達(dá)，從而提高子宮內(nèi)膜容受性，參與胚泡植入的黏附過(guò)程，改善著床障礙，創(chuàng)造良好的受孕環(huán)境，促進(jìn)胚泡著床，為臨床提高再次IVF-ET成功率提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Effect ofErbuZhuyuimproving prescription on pinopodes, LIF, ER and PR expression in mice endometrium

SHIYue,MUGuohua,WULiting,etal.

DepartmentofGgynaecology,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700，China

LIUYanfeng,Email:：liuyaf8888@sina.com

Objective To observe the effect ofErbuZhuyuimproving prescription on pinopodes, LIF, ER and PR expression in endometrium of mice model with dysfunctional embryo implantation. Methods 50 experimental animals were used to establish model of dysfunctional embryo implantation, and the mice were divided into five groups (10 in each group): blank group, model group, western medicine treated group 1 (progynova group), western medicine treated group 2 (aspirin group),ErbuZhuyuimproving prescription group. Pinopodes in uterine endometrium were examined by scanning electron microscopy. LIF, ER and PR expressions were detected by immunohistochemistry. Results Scanning electron microscopy showed that the endometrium ofErbuZhuyuimproving prescription group was more regular and the expression of pinopodes were abundant, and the space between the cells was obvious. Immunohistochemical results showed LIF, ER and PR expression ofErbuZhuyuimproving prescription group were obviously higher than model group (P<0.05). Compared with the progynova group, LIF level ofErbuZhuyuimproving prescription was lower (P<0.05) while ER level was higher, and PR level was no obvious difference(P>0.05), all above index ofErbuZhuyuimproving prescription was equal to the aspirin group. ConclusionErbuZhuyuimproving prescription might regulate the expression of pinopodesand, LIF, ER and PR expression of blastocyst implantation period, improve the endometrial receptivity and contribute to the adhesion of embryo implantation, and to improve and implantation dysfunction, to create a good environment to promote pregnancy and embryo implantation.

ErbuZhuyuimproving prescription; Endometrial receptivity; Pinopodes; Leukemia inhibitory factor; Estrogen receptor; Progesterone receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金(81273789，81473721)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)名老中醫(yī)肖承悰教授學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)研究及傳承工作室；2014年北京中醫(yī)藥大學(xué)薪火傳承項(xiàng)目

100700 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院婦科[石玥(博士研究生)、穆國(guó)華(碩士研究生)、吳麗婷(碩士研究生)、申萌萌(博士研究生)、趙青竹(碩士研究生)、劉雁峰]

石玥(1988- )，女，2014級(jí)在讀博士研究生，醫(yī)師。研究方向：女性不孕癥的中醫(yī)藥防治。E-mail：october5845@163.com

劉雁峰(1963- )，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：女性不孕癥及更年期綜合征的中醫(yī)藥防治。E-mail：liuyaf8888@sina.com

R285.5

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10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.010

2016-08-31)