陳偉 劉海生 魏萌 王麗紅 師艷艷

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熊果酸對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究

陳偉 劉海生 魏萌 王麗紅 師艷艷

目的 研究熊果酸對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。 方法 以不同濃度熊果酸(40、20、10 μg/mL)和順鉑(40 μg/mL)干預(yù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人骨肉瘤MG-63細(xì)胞；采用噻唑藍(lán)比色法測(cè)定細(xì)胞增值抑制率，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡狀況，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)mRNA、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia，bcl-2)mRNA的表達(dá)，采用免疫印跡法(western blotting，WB)檢測(cè)細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表達(dá)。 結(jié)果 經(jīng)熊果酸干預(yù)48小時(shí)能夠顯著提高人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率，延長(zhǎng)細(xì)胞周期G0/G1期并縮短G2/M期，提高細(xì)胞凋亡率(apoptosis index，AI)，上調(diào)Bax mRNA表達(dá)并下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)、提高Bax/bcl-2比值，上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，熊果酸上述作用具有一定的劑量依賴(lài)性。 結(jié)論 熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，其機(jī)制可能與熊果酸能夠阻滯細(xì)胞周期以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

熊果酸； 骨肉瘤； MG-63細(xì)胞； 增殖； 凋亡

骨肉瘤發(fā)病率居原發(fā)惡性骨腫瘤之首[1-2]，每年新發(fā)患者約5/100萬(wàn)[3]，多發(fā)于青少年且死亡率高，是臨床上亟待解決的一個(gè)難題。目前臨床上對(duì)于骨肉瘤的治療主要采取手術(shù)輔以放化療的方案，但80 %的患者因確診時(shí)體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶而致使手術(shù)治療效果不佳[4]，5年生存率僅30 %左右。因此，以抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)為切入點(diǎn)研究高效、低毒的新型抗腫瘤藥物以及新的治療方案是臨床上亟待解決的問(wèn)題。熊果酸(ursolic acid，UA)是一種具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類(lèi)化合物[5-10]，廣泛存在于熊果、女貞子等植物中；現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)肺癌、肝癌、舌癌細(xì)胞等生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用[11-13]，但熊果酸是否對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞并給予熊果酸進(jìn)行干預(yù)治療，研究熊果酸對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株引自河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物研究室；熊果酸購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司(純度≥98%，批號(hào)：140617)；注射用順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司(批號(hào)：1503018)；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司(批號(hào)分別為：15010037、15040127、15050009)；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：M2128)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司(批號(hào)：150419)；Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(20150127)；bcl-2、Bax上下游引物購(gòu)自上海博亞生物公司(批號(hào)分別為：20150216、20150120)。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)(購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司)；酶標(biāo)儀(購(gòu)自美國(guó) BIO-RAD公司)；DYY-11 型多用電泳儀、DYCZ-40B 轉(zhuǎn)印泳槽(購(gòu)自北京六一儀器廠)；流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)BD公司)；RT-PCR儀(購(gòu)自武漢新未來(lái)儀器技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)：0.25%胰酶消化、調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL后分為空白對(duì)照組、熊果酸低、中、高劑量(10、20、40 μg/mL)組和順鉑(40 μg/mL)組，n=10；各組分別給予相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，48小時(shí)后行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增值抑制率的測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/mL，接種于96孔板，每孔滴加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4小時(shí)后去上清，加入DMSO 200 μL，振蕩10分鐘后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光度(optical delnsity，OD)值，計(jì)算各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增值抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.3.3 細(xì)胞周期的檢測(cè)和細(xì)胞凋亡狀況的觀察 各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、加入70%乙醇5 mL混勻并置4℃環(huán)境48小時(shí)后離心取細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌并打散細(xì)胞團(tuán)后加5 μL水解酶Rnase(10 mg/mL)，置37℃環(huán)境1小時(shí)，加入碘化丙啶染液，避光孵育30分鐘，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用CELL Quest軟件分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相及凋亡狀況。

1.3.4 各組MG-63細(xì)胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)的檢測(cè)及Bax/bcl-2比值的計(jì)算 通過(guò)基因文庫(kù)查詢(xún)并設(shè)計(jì)合成bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物；bcl-2引物：上游5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3′，下游5′-TGATTTGACCATTTGC CTGA-3′；bax引物：上游5′-ATCCAGGATCGAGCAGG GAGGATGG- 3′，下游5′-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3′；β-actin引物：上游5′-CCTGTATGCC TCTGGTCGTA-3′，下游 5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。經(jīng)藥物干預(yù)48小時(shí)后，0.25 %胰酶消化并收集各組細(xì)胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，最后通過(guò)凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，以灰度值進(jìn)行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)并計(jì)算Bax/bcl-2表達(dá)比值。

1.3.5 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)PBS溶液洗滌后行超聲裂解，低溫離心(4℃，12000 rpm)20分鐘取沉淀，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性(沸水浴加熱5分鐘)、上樣(每孔上樣30 μg)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，一抗(Caspase-3，β-actin)4℃過(guò)夜，洗膜、二抗(1∶100)室溫孵育1小時(shí)后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測(cè)定Caspase-3表達(dá)相對(duì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用軟件SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率

通過(guò)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果如表1所示：熊果酸各劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，且熊果酸對(duì)MG-63細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)性；熊果酸高劑量組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于順鉑組(P<0.05)。

表1 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制率比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與順鉑組比較，bP<0.05。

2.2 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果如表2所示：熊果酸中、高劑量組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期G0/G1期較空白對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，S期和G2/M期顯著縮短(P<0.05，P<0.01)，其中熊果酸高劑量組較順鉑組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與順鉑組比較，cP<0.05。

2.3 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況，結(jié)果如圖1所示：經(jīng)熊果酸各劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，熊果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性；計(jì)算AI結(jié)果如表3所示：熊果酸各劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞AI顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，其中熊果酸高劑量組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞AI顯著高于順鉑組(P<0.05)。

表3 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與順鉑組比較，bP<0.01。

注：A空白對(duì)照組；B熊果酸低劑量組；C熊果酸中劑量組；D熊果酸高劑量組；E順鉑組

β-actin mRNA bcl-2 mRNA Bax mRNA

注：自左至右依次為：空白對(duì)照組、熊果酸低劑量組、熊果酸中劑量組、熊果酸高劑量組、順鉑組

圖2 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)

2.4 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)和Bax/bcl-2比值

采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)并通過(guò)灰度值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如圖2和表4所示：熊果酸中、高劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，且Bax mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，Bax/bcl-2比值顯著提高(P<0.05，P<0.01)；其中熊果酸高劑量組bcl-2 mRNA表達(dá)較順鉑組顯著降低(P<0.05)、Bax/bcl-2比值顯著升高(P<0.05)。

表4 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)和Bax/bcl-2值對(duì)比

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與順鉑組比較，cP<0.05。

2.5 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)

通過(guò)Western blotting技術(shù)檢測(cè)并通過(guò)灰度值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果如圖3和表5所示：熊果酸各劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，熊果酸對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的調(diào)控作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性；熊果酸高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于順鉑組(P<0.05)。

注：自左至右依次為：空白對(duì)照組、熊果酸低劑量組、 熊果酸中劑量組、熊果酸高劑量組、順鉑組

圖3 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)

表5 各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與順鉑組比較，cP<0.05。

3 討論

熊果酸是一種具有多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類(lèi)化合物[5-10]，近年來(lái)熊果酸抗腫瘤活性逐漸得到醫(yī)藥研究工作者的關(guān)注，付倫等[11]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期而對(duì)肺癌A549細(xì)和SPCA1細(xì)胞增殖起到抑制作用；崔兵兵等[12]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；李?lèi)?ài)霞等[13]發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠誘導(dǎo)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡而抑制其生長(zhǎng)；此外，熊果酸對(duì)卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用[14-15]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞并給予不同濃度熊果酸進(jìn)行干預(yù)并以順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸能夠呈劑量依賴(lài)性地阻滯人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期、抑制增殖并提高其細(xì)胞凋亡率，且熊果酸高劑量組均優(yōu)于順鉑組，提示熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。

Caspase是激活各種凋亡刺激因子(Apaf-1)的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及整個(gè)凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)；bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結(jié)合而抑制Caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細(xì)胞毒性作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[16-17]；Bax屬于Bcl-2基因家族成員，具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變而釋放細(xì)胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[18]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸能夠有效上調(diào)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)、下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)并提高Bax/bcl-2比值，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，這可能是熊果酸誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

總之，熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的藥理學(xué)作用，其作用機(jī)制可能與熊果酸阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因(Bax、bcl-2)和蛋白(Caspase-3)表達(dá)有關(guān)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells

CHENWei，LIUHaisheng，WEIMeng，etal.

ThirdDepartmentofOrthopedics，HandanCentralHospital，Handan056001，China

CHENWei,E-mail:hdsyyzhrf@163.com

Objective To investigate the effects of Ursolic Acid(UA) on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells. Methods The human osteosarcoma MG-63 cells in logarithmic growth phase was treated with UA (10, 20, 40μg/mL) and Cisplatin (40μg/mL). The cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, the expression of Bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, the expression of caspase-3 protein was detected by western blotting. Results The cellular growth inhibition rate of human osteosarcoma MG-63 cell in UA treated groups were significantly increased; the G0/G1 phase of the cell cycle was prolonged and the G2/M phase was shortened, the apoptosis rate was significantly increased; the expression of Bax mRNA was significantly increased, while the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased, and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased; the expression of caspase-3 protein was significantly increased; all of the effects above were dose-dependent with a certain. Conclusions UA can effectively inhibit human osteosarcoma MG-63 proliferation and promote it apoptosis, which perhaps related to its effects of arresting cell cycle and regulating the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Ursolic Acid; Osteosarcoma; MG-63 cell; Proliferation; Apoptosis

056001 邯鄲市中心醫(yī)院骨三科(陳偉、魏萌、王麗紅、師艷艷)；邯鄲市人民醫(yī)院外一科(劉海生)

陳偉(1976- )，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：骨科疾病研究。E-mail：hdsyyzhrf@163.com

R738.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.013

2016-07-03)