姚婉玉 唐秀生

?

·論著·

MCPIP1和IL-17c在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)

姚婉玉 唐秀生

目的： 檢測(cè)MCPIP1和IL-17c在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá)。方法： Real-time PCR及免疫熒光檢測(cè)45例尋常型銀屑病患者皮損及19例正常皮膚中MCPIP1和IL-17c mRNA及蛋白表達(dá)水平，皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析MCPIP1和IL-17c的相關(guān)性。結(jié)果： 銀屑病組MCPIP1、 IL-17c mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.8497±0.0661和0.4027±0.04158，對(duì)照組中分別為0.2921±0.06135和0.2374±0.02525， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MCPIP1和IL-17c mRNA水平具有明顯相關(guān)性(P<0.05)?；颊呓M皮損中MCPIP1和IL-17c的蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組。結(jié)論： MCPIP1和IL-17c可能共同影響尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

尋常型銀屑??； MCPIP1； IL-17c

銀屑病是一種多基因遺傳背景下的慢性炎癥介導(dǎo)的皮膚病。白介素-17(Interleukin-17，IL-17)家族在銀屑病中的作用備受矚目，諸多研究表明T輔助細(xì)胞17(T help cell 17，Th17)細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。抗IL-17a的抗體在治療斑塊狀銀屑病、銀屑病型關(guān)節(jié)炎中效果明顯[2]。IL-17c主要由上皮細(xì)胞分泌并介導(dǎo)一系列抗炎、抗凋亡的基因行使發(fā)揮功能。文獻(xiàn)報(bào)道在銀屑病患者皮損中IL-17c的蛋白濃度比IL-17a的濃度高125倍左右[3]。另外，小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞特異性的高表達(dá)IL-17c能夠引起一自發(fā)的銀屑病皮損表型[3]。這些都提示我們IL-17c在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中有著舉足輕重的作用。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 induced protein-1, MCPIP1)由ZC3H12A基因編碼，又稱regnase-1，是MCPIP家族中的一員，該家族成員的標(biāo)志性特征是都含有一個(gè)CCCH鋅指結(jié)構(gòu)[4]。MCPIP1是重要的負(fù)相調(diào)控炎癥因子的蛋白，這種調(diào)控主要通過(guò)識(shí)別如IL-6等炎癥因子的mRNA 3’-UTR莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)[5]，研究證實(shí)：MCPIP1也可負(fù)相調(diào)控T細(xì)胞關(guān)鍵因子IL-2，從而參與T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[6]。Monin等[7]提出在皮膚炎癥反應(yīng)中，MCPIP1能負(fù)性調(diào)控IL-17c信號(hào)轉(zhuǎn)達(dá)。因此，我們采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及免疫熒光法，對(duì)45例尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的蛋白與mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行研究，對(duì)MCPIP1及細(xì)胞因子IL-17c的表達(dá)及兩者間的相關(guān)性與其在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例患者均來(lái)自2015年4月至2016年10月我院收治的尋常型銀屑病患者，符合尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且無(wú)腫瘤、自身免疫病、重度感染、嚴(yán)重肝腎功能障礙等合并癥。其中男29例，女16例，年齡14～69歲，平均34.52歲；發(fā)病年齡11天～35年，平均7.3年；有家族史6例，無(wú)家族史39例；45例中28例為首發(fā)患者，未曾接受過(guò)任何治療，有9例患者近3個(gè)月內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及外用藥治療。采用通用的銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評(píng)分法(PASI)對(duì)所收集的尋常型銀屑病患者進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評(píng)分。為保證PASI評(píng)分的一致性和客觀性，所有患者的PASI評(píng)分均由同一實(shí)驗(yàn)者來(lái)完成。45例入組患者的評(píng)分3.5～26.8，平均11.00。正常對(duì)照組19例來(lái)自本院整形及皮膚外科手術(shù)切除的正常皮膚，均無(wú)免疫系統(tǒng)疾病及相關(guān)家族史。其中男8例，女11例，年齡20～59歲，平均29.73歲，銀屑病患者組及正常對(duì)照組在年齡、性別上差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入選患者均已簽署知情同意書(shū)。取材后，將標(biāo)本分為2份，一份立即置于液氮中冷凍保存，另一份置于10%福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑 Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)(日本Takara公司)，MCPIP1和IL-17C的引物均購(gòu)自生工，MCPIP1抗體(Abcam公司)，IL-17c抗體(Abcam公司)，驢抗兔IgG二抗，Alexa Fluor?594 conjugate(Life公司)，羊抗鼠IgG二抗，Alexa Fluor?488 conjugate(Life公司)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)患者與對(duì)照組皮損組織中MCPIP1和IL-17c mRNA表達(dá)

1.3.1 總RNA的抽提 將儲(chǔ)存在液氮的一部分皮膚組織(100 mg)分別加入1 mL Trizol，嚴(yán)格在無(wú)酶條件下手工抽提總RNA。樣本于-80℃冰箱凍存。紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度(U/μL )，計(jì)算A260/A280比值，檢測(cè)RNA濃度。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA從-80℃冰箱取出，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別完成以下兩步：第一去除基因組DNA，第二逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：加入第一步反應(yīng)所得體系10 μL，5X PrimeScript Buffer2 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，加無(wú)酶水至20 μL，混勻后瞬時(shí)離心，37℃反應(yīng)15 mins，85℃ 5 sec終止反應(yīng)，得到的cDNA-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.3 Real-time PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR) 依照SYBR? Premix Ex TaqTM(日本Takara公司)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。使用Light Cycler96熒光定量PCR儀，檢測(cè)MCPIP1和IL-17c mRNA的表達(dá)，目的及內(nèi)參GAPDH Real-time PCR上下游引物(表1)。

1.3.4 免疫熒光檢測(cè)患者與對(duì)照組皮損組織中MCPIP1和IL-17c的表達(dá) 將所得標(biāo)本常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋并切制成厚度為0.4 μm的連續(xù)切片。檢測(cè)前進(jìn)行脫蠟、梯度酒精脫水，檸檬酸高壓熱修復(fù)，5% BSA室溫封閉1 h，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)分別滴加1% BSA配置MCPIP1和IL-17c的一抗，4℃孵育過(guò)夜，第二天取出PBS清洗后，分別使用相對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，PBS再次洗滌三次，每次5 min，DAPI核染后，顯微鏡下觀察熒光成像。

表1 Real-time PCR引物

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS18.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)分析其相關(guān)性，P<0.05認(rèn)為具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 皮損中MCPIP1和IL-17c的轉(zhuǎn)錄水平及相關(guān)性分析 銀屑病患者組皮損中MCPIP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)值0.8497±0.0661，正常對(duì)照組為0.2921±0.06135，P<0.005(圖1a)；銀屑病患者組皮損中IL-17c mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.4027±0.04158，正常對(duì)照組為0.2374±0.02525，P<0.005(圖1b)。銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17A mRNA的表達(dá)值均明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，通過(guò)相關(guān)性分析可知MCPIP1和IL-17A的表達(dá)密切相關(guān)，r=-0.7744，P<0.0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2 皮損中MCPIP1和IL-17c蛋白的表達(dá)情況 正常對(duì)照組皮損中見(jiàn)少量散在分布的IL-17c熒光染色的細(xì)胞(圖3a)；銀屑病組皮損中的IL-17c呈熒光染色的細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多(圖3b)。同時(shí)，銀屑病患者組MCPIP1表達(dá)也較正常對(duì)照組明顯增多(圖4a，圖4b，圖5a，圖5b)。

圖1 MCPIP1(1a)和IL-17c(1b)在銀屑病和正常對(duì)照皮損中的mRNA的表達(dá)情況。銀屑病患者：N正常對(duì)照=30：19(**P<0.01) 圖2 MCPIP1和IL-17c表達(dá)的相關(guān)性分析

圖3 IL-17c在銀屑病(3a)和正常對(duì)照(3b)皮損中的表達(dá)情況，其中綠色顯示為IL-17c，藍(lán)色為DAPI(×400)

圖4 MCPIP1在銀屑病(4a)和正常對(duì)照(4b)皮損中的表達(dá)情況，其中紅色顯示為MCPIP1，藍(lán)色為DAPI(×400)

圖5 IL-17c(5a)和MCPIP1(5b)在銀屑病和正常對(duì)照皮損中的表達(dá)情況(**P<0.01)

3 討論

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫熒光的方法對(duì)尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)與定量分析，與對(duì)照組相比，銀屑病皮損中MCPIP1和IL-17c的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。

IL-17c在銀屑病的炎癥浸潤(rùn)中發(fā)揮著重要的作用。有研究證明：銀屑病小鼠模型揭示IL-17家族細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)銀屑病的發(fā)展。同樣，給咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠皮下注射IL-17c會(huì)引起皮膚內(nèi)淋巴細(xì)胞募集增多[9]；在同樣予以咪喹莫特處理的小鼠中，IL-17c敲除小鼠較對(duì)照鼠而言，所誘導(dǎo)的銀屑病癥狀明顯減輕[9]。此外，在角質(zhì)形成細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IL-17c會(huì)自發(fā)產(chǎn)生類(lèi)似人類(lèi)銀屑病樣皮損[3]。另有研究報(bào)道，IL-17a和IL-17c在人類(lèi)銀屑病皮損的表達(dá)明顯增高[7]，這與本研究中實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光的結(jié)果一致。

全基因組關(guān)聯(lián)分析確定了一系列和銀屑病相關(guān)的免疫相關(guān)通路上的調(diào)節(jié)因子，據(jù)報(bào)道ZC3H12A基因上有11個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)和人類(lèi)疾病之間的關(guān)聯(lián)[10]。雖然MCPIP1在銀屑病患者的皮損中表達(dá)升高已經(jīng)得到證實(shí)，且與我們的結(jié)果相同，但ZC3H12A是不是IL-17的靶基因仍有待研究驗(yàn)證，據(jù)Monin等[7]報(bào)道皮膚炎癥反應(yīng)中，MCPIP1能抑制IL-17c信號(hào)傳導(dǎo)，這也間接證明了我們的結(jié)論。

本文通過(guò)對(duì)尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病皮損中MCPIP1和IL-17c的表達(dá)明顯升高，提示MCPIP1和IL-17c的水平與銀屑病的病程變化和發(fā)展有關(guān), 可以用來(lái)協(xié)助銀屑病的診斷和治療。本研究對(duì)MCPIP1和IL-17c在銀屑病患者皮損中的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行了初步探討, 其對(duì)銀屑病發(fā)病的影響及與其他趨化因子和細(xì)胞因子相互作用的機(jī)制,尚有待于更深入的研究。

[1] Miossec P, Korn T, Kuchroo VK. Interleukin-17 and type 17 helper T cells[J]. N Engl J Med,2009,361(9):888-898.

[2] Langley RG, Elewski BE, Lebwohl M, et al. Secukinumab in plaque psoriasis--results of two phase 3 trials[J]. N Engl J Med, 2014, 371(4):326-338.

[3] Johnston A, Fritz Y, Dawes SM, et al. Keratinocyte overexpression of IL-17C promotes psoriasiform skin inflammation[J]. J Immunol,2013,190(5):2252-2262.

[4] Zhou L, Azfer A, Niu J, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 induces a novel transcription factor that causes cardiac myocyte apoptosis and ventricular dysfunction[J]. Circ Res,2006,98(9):1177-1185.

[5] Mizgalska D, Wegrzyn P, Murzyn K, et al. Interleukin-1-inducible MCPIP protein has structural and functional properties of RNase and participates in degradation of IL-1β mRNA[J]. FEBS J,2009,276(24):7386-7399.

[6] Li M, Cao W, Liu H, et al. MCPIP1 down-regulates IL-2 expression through an ARE-independent pathway[J]. PLoS One,2012,7(11):e49841.

[7] Monin L, Gudjonsson JE, Childs EE, et al. MCPIP1/Regnase-1 Restricts IL-17A- and IL-17C-Dependent Skin Inflammation[J]. J Immunol,2016,198(2):767-775.

[8] 張學(xué)軍.皮膚性病學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.141-144.

[9] Ramirez-Carrozzi V, Sambandam A, Luis E, et al. IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner[J]. Nat Immunol,2011,12(12):1159-1166.

[10] Cifuentes RA, Cruz-Tapias P, Rojas-Villarraga A, et al. ZC3H12A (MCPIP1): molecular characteristics and clinical implications[J]. Clin Chim Acta,2010,411(23-24):1862-1868.

(收稿：2016-12-28 修回：2017-02-18)

·病例報(bào)告·

Expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris

YAOWanyu,TANGXiusheng.

DepartmentofDermotology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,Guangxi,China

TANGXiusheng,E-mail:tangxsh6199@126.com

Objective: To detect the expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris. Methods: The expression levels of MCPIP1 and IL-17c mRNA and protein in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris and the normal skin samples in 19 controls were detected by Real-time PCR and immunofluorescence technique. The association between the levels of MCPIP1 and IL-17c in the patients were assessed by Pearson correlation coefficient. Results: The level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was 0.8497±0.0661 and 0.4027±0.04158, which was higher than those in controls (0.2921±0.06135 and 0.2374±0.02525) with significant differences (P<0.05). There was obvious correlation between the level of MCPIP1 and IL-17c mRNA. The protein level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was higher than that in normal controls. Conclusion: MCPIP1 can interact with IL-17c, which influences the development of psoriasis.

psoriasis vulgaris; MCPIP1; IL-17c

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西百色，533000

唐秀生，E-mail: tangxsh6199@126.com