賀 琪 朱 旋 皮先明 石 全 李家文 胡 楓

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·論著·

扁平苔蘚皮損中microRNA-155的表達(dá)及與Th17/Treg失衡的相關(guān)性

賀 琪1，3朱 旋2，3皮先明1，3石 全1，3李家文4胡 楓5

目的： 檢測(cè)microRNA-155(miR-155)在皮膚扁平苔蘚(CLP)中的表達(dá)，明確其與輔助性T細(xì)胞17 /調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)失衡的相關(guān)性。方法： 應(yīng)用TaqMan探針?lè)z測(cè)33例CLP患者和25名健康對(duì)照者外周血中miR-155，孤兒受體-γt(RORγt)，白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)，叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)和IL-10的基因表達(dá)水平。結(jié)果： CLP中miR-155，RORγt、Foxp3和IL-17A 的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，而IL-10的表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；CLP組中，miR-155分別與RORγt、Foxp3和IL-17A的含量顯著正相關(guān)(均P<0.001)，與IL-10的含量無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論： CLP中的miR-155過(guò)表達(dá)可能與Th17/Treg失衡有關(guān)。

microRNA-155； 扁平苔蘚； 輔助性T細(xì)胞17； 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 白細(xì)胞介素-17A

micro-RNA(miRNA)在自身免疫病中的作用正逐漸被發(fā)現(xiàn)并重視。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)患者體內(nèi)存在microRNA-155(miR-155)表達(dá)上調(diào)[1,2]和輔助性T細(xì)胞17 /調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-helper 17 cell/regulatory T cell，Th17/Treg)免疫失衡[3]。研究證實(shí)miR-155是新型促炎CD4+T細(xì)胞亞類(lèi)Th17細(xì)胞和對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞具有抑制作用的Treg細(xì)胞分化增殖的關(guān)鍵調(diào)控成分[4]，故本研究應(yīng)用TaqMan探針?lè)ǖ确椒z測(cè)miR-155，Th17細(xì)胞的標(biāo)志因子孤兒受體-γt(retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma，RORγt)和主要效應(yīng)因子白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)，以及Treg細(xì)胞的標(biāo)志因子叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)和主要效應(yīng)因子IL-10在皮膚扁平苔蘚(cutaneous lichen planus，CLP)患者外周血中的表達(dá)與關(guān)聯(lián)，以探討miR-155在CLP中的表達(dá)及其與Th17/Treg失衡的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 CLP組外周血標(biāo)本取材自2014年1月至2016年10月于我院皮膚科就診的門(mén)診患者，均經(jīng)臨床和病理確診為CLP，共33例(男18例，女15例，年齡15～65歲，平均38.66±9.36歲)；所有患者均未患其他皮膚病，一個(gè)月內(nèi)未接受系統(tǒng)治療，兩周內(nèi)未接受局部治療。對(duì)照組外周血標(biāo)本取材自同期我院健康體檢者，共25名(男16名，女9名，年齡19～58歲，平均25.12±10.22歲)，既往體健。本研究已獲湖北省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有參與者的知情同意。

1.2 合成引物和探針 依照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)miR-155和內(nèi)參U6核內(nèi)小RNA(small nuclear RNA，snRNA)的引物和探針。miR-155 上游引物5’-GCCGTTAATGCTAATCGTGAT-3’，下游引物5’-TGGGTTCATTTCTGGGTCTT-3’，探針序列FAM-TCTATTCCATTGGTCTACT-MGB，U6 snRNA上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，探針序列FAM-AACGATACAGAGAAGATT-MGB，探針均以各自的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄特異性引物，以上由上海捷瑞公司合成。RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A，IL-10和內(nèi)參β-actin的引物信息見(jiàn)表1。

表1 人類(lèi)基因引物列表

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TaqMan探針?lè)?應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)法檢測(cè)miR-155和內(nèi)參U6 snRNA。用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按參照總RNA提取試劑盒(寶曼，上海)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，應(yīng)用紫外光分光光度法調(diào)整濃度到50 ng/μL。應(yīng)用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI，USA)合成cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。應(yīng)用TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，USA)行Real-time PCR操作，陰性對(duì)照用去離子水代替cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)3次。

1.3.2 SYBR Green I染料法 應(yīng)用SYBR Green I染料qRT-PCR法檢測(cè)RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A，IL-10和內(nèi)參β-actin。提取總RNA的步驟如上文，濃度調(diào)整至1 g/L。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，USA)行cDNA合成，采用FastStart Universal SYBR Green MasterRox(Roche，Germany)行Real-time PCR操作，陰性對(duì)照用去離子水代替cDNA，反應(yīng)條件為95℃ 10 min，94℃ 15 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5 min。每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)三次。所有PCR檢測(cè)結(jié)果使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI，USA)行定量分析，用內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 miR-155、RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10的表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A在CLP組中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而IL-10的表達(dá)顯著降低(圖1)。

2.2 miR-155，RORγt，F(xiàn)oxp3，IL-17A和IL-10之間的關(guān)聯(lián) 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLP組中miR-155的表達(dá)水平分別與RORγt、Foxp3和IL-17A的含量顯著正相關(guān)，RORγt與IL-17A的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖2)；而IL-10與miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.106，r=-0.095，r=0.223，r=-0.017，均P>0.05)。

圖1 a:TaqMan探針?lè)z測(cè)miR-155在對(duì)照組和CLP組中的基因表達(dá)水平；b:SYBR Green I染料法檢測(cè)RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10在對(duì)照組和CLP組中的基因表達(dá)水平

圖2 a：CLP組中，miR-155與RORγt的基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性；b:CLP組中，miR-155與Foxp3的基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性；c:CLP組中，miR-155與IL-17A基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性；d:CLP組中，RORγt與IL-17A基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性

3 討論

CLP是一種丘疹鱗屑性發(fā)疹性皮膚病，其發(fā)病涉及感染、免疫、精神等諸多因素。miRNA是一類(lèi)包含18-25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在哺乳動(dòng)物中含量豐富，能在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)mRNA進(jìn)行關(guān)鍵性負(fù)調(diào)控[5]。有學(xué)者報(bào)道m(xù)iR-155在OLP患者外周血和皮損中表達(dá)升高[1,2]，本研究發(fā)現(xiàn)miR-155在CLP患者外周血中的表達(dá)亦顯著上調(diào)，提示miR-155的異常表達(dá)與CLP的發(fā)病有關(guān)，然而其具體功能和機(jī)制尚不清楚。

本次研究的結(jié)果顯示RORγt，F(xiàn)oxp3和IL-17A在CLP患者外周血中表達(dá)均顯著上調(diào)，而IL-10的含量明顯下調(diào)，這幾種因子在CLP中的表達(dá)情況與此一致[3,6,7]，提示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞皆參與了LP的發(fā)病，在患者體內(nèi)異常增殖，且疾病進(jìn)程中存在Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)和Treg細(xì)胞功能受損。本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLP患者外周血中miR-155的含量與RORγt，F(xiàn)oxp3和IL-17A的含量均呈顯著正相關(guān)，而IL-10的含量與miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表達(dá)水平皆沒(méi)有明顯相關(guān)性，提示CLP中的miR-155過(guò)表達(dá)與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的異常增殖及Th17功能亢進(jìn)有關(guān)，而Treg細(xì)胞功能受損與miR-155和Th17細(xì)胞的數(shù)量和功能變化無(wú)直接關(guān)聯(lián)。

文獻(xiàn)報(bào)道小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞高表達(dá)miR-155可致RORγt和Foxp3表達(dá)上調(diào)，IL-17含量升高，而對(duì)CD4+T細(xì)胞抑制miR-155的表達(dá)則出現(xiàn)與上述相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，另一方面Treg細(xì)胞的主要效應(yīng)因子IL-10和TGF-β1的含量不受miR-155表達(dá)變化的影響[4]，本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與以上基本一致。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Treg等免疫細(xì)胞分泌的IL-10能夠阻止Th17細(xì)胞分泌IL-17，進(jìn)而抑制Th17介導(dǎo)的免疫炎癥[8]。因此可以推測(cè)，CLP中高表達(dá)的miR-155促使Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化增殖以及IL-17分泌增加，但對(duì)IL-10的分泌沒(méi)有明顯影響，同時(shí)CLP中IL-10表達(dá)顯著下調(diào)，故無(wú)法有效抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥，致使Th17/Treg失衡出現(xiàn)或加重，疾病發(fā)生或發(fā)展。

綜上所述，CLP中存在外周血miR-155過(guò)表達(dá)，與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化增殖以及Th17功能亢進(jìn)有關(guān)，與Treg功能無(wú)關(guān)，可能涉及Th17/Treg失衡的調(diào)控。本研究首次探討CLP中miR-155的表達(dá)與Th17/Treg失衡的關(guān)系，為CLP的發(fā)病機(jī)理和miR-155的功能機(jī)制提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為CLP的靶向治療提供了新思路。但仍存在許多問(wèn)題，例如CLP中miR-155的具體作用和機(jī)理，與Th17/Treg失衡的具體關(guān)聯(lián)和機(jī)制，IL-10異常表達(dá)的機(jī)制及其對(duì)Th17/Treg失衡和免疫炎癥的具體影響等，均有待進(jìn)一步研究探討。

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(收稿：2017-01-05 修回：2017-02-15)

Expression of microRNA-155 and the relationship with imbalance of Th17/Treg in the patients with lichen planus

HEQi1，3,ZHUXuan2，3,PIXianming1，3,SHIQuan1，3,LIJiawen4,HUFeng5.

1.DepartmentofDermatology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 2.DepartmentofUrology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 3.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430074,China; 4.DepartmentofDermatology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China; 5.DepartmentofDermatology,WuhanFirstHospital,Wuhan430030,China

HEQi,E-mail:catty0004@163.com

Objective: To detect the expression level of microRNA-155 (miR-155) and to determine the relationship with the imbalance of T-helper 17 cell/regulatory T cell (Th17/Treg) in the patients with cutaneous lichen planus (CLP). Methods: The expression of miR-155, retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma (RORγt), interleukin-17A (IL-17A), forkhead box P3 (Foxp3) and IL-10 in peripheral blood of 33 patients with CLP and 25 normal controls were detected by TaqMan probe. Results: Compared with the normal controls, the expression levels of miR-155, RORγt, Foxp3 and IL-17A were higher and the level of IL-10 expression was lower in the CLP patients with CLP (P<0.05). The level of miR-155 expression was positively correlated with the expression levels of of RORγt, Foxp3 and IL-17A in the patients with CLP (Ps<0.001). There was no correlation between the expression level of miR-155 and IL-10. Conclusion: The miR-155-upregulation existed in the CLP patients may be associated with the imbalance of Th17/Treg.

microRNA-155; lichen planus; T-helper 17 cell; regulatory T cell; interleukin-17A

武漢市科技局青年科技晨光計(jì)劃項(xiàng)目 (編號(hào)：2015071704011621) 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81502735)

1湖北省中醫(yī)院皮膚科，武漢，430061 2湖北省中醫(yī)院泌尿外科，武漢，430061 3湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢，430074 4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢，4300225武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢，430030

賀琪,E-mail: catty0004@163.com