馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

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·論著·

CD8+T細胞對白癜風患者黑素細胞的殺傷機制

馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

目的： 明確CD8+T細胞對白癜風患者黑素細胞的殺傷機制。方法： 分選白癜風患者及正常人外周血CD8+T細胞，分別與原代黑素細胞及永生化正常黑素細胞系PIG1及永生化白癜風黑素細胞系PIG3V建立共孵育殺傷模型，采用流式細胞術檢測靶細胞被殺傷情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測殺傷環(huán)境中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平。結果： 白癜風患者外周血CD8+T細胞殺傷原代黑素細胞及PIG3V能力，分泌IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素水平均高于健康對照，而殺傷PIG1能力和TNF-α水平并無顯著差異；白癜風患者CD8+T細胞IFN-γ分泌水平與細胞殺傷率呈明顯正相關。結論： 白癜風患者CD8+T細胞殺傷黑素細胞是白癜風發(fā)病的重要機制，且該殺傷作用可能依賴IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素分泌水平的上調。

白癜風； CD8+T細胞； 干擾素γ； 顆粒酶B； 穿孔素

白癜風是一種常見的由黑素細胞選擇性破壞導致的體表黑素減退性疾病，全球發(fā)病率近1%。目前白癜風發(fā)病機制不清，有許多病因學理論，包括黑素細胞自身破壞學說、生化學說、神經(jīng)起源學說、自身免疫學說、遺傳學說等[1,2]。CD8+T細胞殺傷作用被認為是白癜風發(fā)病的重要機制之一，但具體機制仍不清。本文通過測定白癜風患者CD8+T細胞對正常人表皮黑素細胞及永生化黑素細胞系殺傷作用及相關細胞因子表達量，進一步探討CD8+T細胞誘發(fā)白癜風的相關機制。

1 材料和方法

1.1 細胞(細胞系)及組織來源 原代黑素細胞由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科提供，取自8～22歲健康青年男性包皮術后組織(共8例)；PIGI細胞系(人表皮永生化黑素細胞系)及PIG3V細胞系(白癜風表皮永生化黑素細胞系)由美國芝加哥大學Le Poole教授惠贈；白癜風患者血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院進展期白癜風患者外周血(共8例)，對照組血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院健康志愿者外周血(共8名)。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及主要儀器 254培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，人黑素細胞生長添加劑購于美國Cascade Biologics公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購于美國Sigma公司，H2O2原液購于日本TAKARA公司，鼠抗人CD8單克隆抗體購于美國Abcam公司，PerCP-Cy5.5-抗人CD8流式抗體購于美國eBioscience公司，碘化丙啶染色液(PI)購于碧云天生物技術有限公司，人IFN-γ、TNF-α ELISA檢測試劑盒購于美國RD公司，人顆粒酶B ELISA及穿孔素ELISA檢測試劑盒購于美國RD公司。流式細胞分選及分析儀購于美國BD公司，酶標儀購自于美國BIO-RAD公司。

1.3 殺傷環(huán)境的建立及殺傷細胞比率檢測 使用254無血清培養(yǎng)基配制0.75 mmol/L H2O2處理靶細胞(原代黑素細胞及PIG1、PIG3V細胞系)誘導發(fā)生抗原暴露，分別于離心管內(nèi)種植靶細胞1×105個細胞/管，并分別向各組管內(nèi)加入2×105個細胞/管對照組或白癜風患者通過磁珠分選出的CD8+T細胞(CD8+T細胞與原代黑素細胞、PIG1細胞及PIG3V細胞HLA分型適配)，按2∶1的細胞數(shù)比例建立CD8+T細胞與黑素細胞(原代黑素細胞、PIG1細胞及PIG3V細胞)的殺傷體系；將各組離心管進行800 rpm×5 min離心，使效應細胞與靶細胞緊密結合，37℃過夜孵育16 h，棄上清液，加入200 μL/管PBS重懸細胞，隨后加入PI并調整濃度至1 μg/mL，混勻震蕩，室溫避光染色15 min；1 h內(nèi)采用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.4 ELISA檢測殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素含量 按照1.3步驟建立CD8+T細胞與PIG1、PIG3V細胞殺傷體系；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒來源見1.2，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計軟件及統(tǒng)計圖制作 所有實驗均進行了三次獨立重復后統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件，各組間均數(shù)比較采用雙向方差分析及studentt檢驗，用直線相關分析法處理指標間的關系，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD8+T細胞殺傷黑素細胞比例 白癜風患者CD8+T細胞對原代黑素細胞殺傷率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(圖1a，P=0.003)。白癜風患者CD8+T細胞殺傷對PIG3V細胞比例較對照組明顯升高(P=0.0411)，而在PIG1細胞中兩者無明顯差異(圖1b，P=0.1467)；在對照組和白癜風患者組中，CD8+T細胞對PIG3V細胞的殺傷作用明顯高于對PIG1的殺傷作用，差異有統(tǒng)計學意義(圖1b，P=0.025)。

圖1 a.白癜風患者及正常人群CD8+T細胞致原代黑素細胞死亡比例(n=8，**P<0.01)；b.白癜風患者及正常人群CD8+T細胞致PIG1、PIG3V細胞死亡比例(n=8，*P<0.05)

2.2 ELISA實驗檢測殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平 白癜風患者組CD8+T細胞殺傷PIG1及PIG3V細胞時IFN-γ分泌水平較對照組明顯升高(圖2a，PIG1組P=0.0119、PIG3V組P=0.0101)，而TNF-α分泌水平并無明顯變化(PIG1組P=0.3089、PIG3V組P=0.4498)。白癜風患者CD8+T細胞殺傷PIG1及PIG3V細胞時顆粒酶B的分泌水平較對照組顯著升高(P<0.001)，但在PIG1及PIG3V細胞間無明顯差異(圖2b)。白癜風患者CD8+T細胞殺傷PIG1及PIG3V細胞時穿孔素分泌水平較對照組顯著升高(P<0.001)，且針對PIG3V細胞分泌的穿孔素水平明顯高于針對PIG1細胞的分泌水平(圖2c，P=0.0015)。

圖2 白癜風患者及正常人群CD8+T細胞與PIG1、PIG3V共孵育環(huán)境中IFN-γ (a，n=5，*P<0.05)、顆粒酶B(b，n=7，***P<0.001)及穿孔素(c，n=6，**P<0.01，***P<0.001)表達水平

3 討論

CD8+T細胞在多種自身免疫相關疾病中發(fā)揮作用。有報道斑禿患者及銀屑病患者外周血中CD8+T細胞數(shù)量上升[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞介導殺傷黑素細胞是白癜風重要的發(fā)病機制之一。有研究認為白癜風患者血液及皮損中均可出現(xiàn)抗黑素細胞的CD8+T細胞，且數(shù)量與疾病嚴重程度相關。同時，白癜風患者CD8+T細胞能夠殺傷無皮損部位的黑素細胞[4]，提示CD8+T細胞的殺傷作用與疾病進展密切相關。Zhang等[5]報道非節(jié)段型白癜風患者活躍期表達皮膚歸巢CD8+T細胞中趨化因子受體CCR4表達水平明顯升高。Byrne等[6]研究發(fā)現(xiàn)白癜風受累的小鼠CD8+T細胞可針對黑素細胞分化抗原TRP2反應。本研究通過流式細胞實驗發(fā)現(xiàn)在原代黑素細胞及永生化細胞系中，白癜風患者的CD8+T細胞均可誘導黑素細胞殺傷增加，也進一步證明了上述觀點。

CD8+T細胞誘發(fā)白癜風的分子機制方面，有研究認為T細胞能夠通過胞內(nèi)聯(lián)接引導Fas配體(FasL)與靶細胞上凋亡相關的Fas分子結合，從而誘導靶細胞凋亡[7]。然而也有文獻報道在白癜風患者中CD8+T細胞FasL含量并無明顯上升，提示FasL可能在白癜風黑素細胞死亡中沒有重要意義[8]。Lili等[9]通過實驗測定白癜風患者CD3+T細胞中IFN-γ+CD8+T細胞、顆粒酶B+CD8+T細胞(GrB+CD8+T細胞)及穿孔素+CD8+T細胞(Perforin+CD8+T細胞)比例較正常人明顯升高。本研究建立的殺傷環(huán)境中，白癜風患者組上清液的IFN-γ，顆粒酶B及穿孔素水平均有不同程度升高，也從另一角度證實白癜風患者表達IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素的CD8+T細胞比例升高。同時，在白癜風患者CD8+T細胞參與的殺傷環(huán)境中，PIG3V細胞組上清中的穿孔素含量較PIG1細胞也明顯升高，說明白癜風患者的黑素細胞可能存在某種機制誘導Perforin+CD8+T細胞增殖或促進CD8+T細胞表達分泌穿孔素。Zhang等[5]通過實驗也認為白癜風患者表皮內(nèi)可能存在某種抗原誘使CD8+T細胞增殖及歸巢，且這一現(xiàn)象中存在CCR4的參與,但具體發(fā)生機制仍待進一步研究。

[1] 張成,唐金,劉建蘭,等.單核苷酸多態(tài)性rs2236313與漢族人尋常型白癜風臨床表型的相關性研究[J].中國麻風皮膚病雜志,2011,27(7):451-454.

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-10-26)

Mechanism of CD8+T cells killing melanocytes in the patients with vitiligo

MAJinyuan,YANGYuqi,LIShuli,GUOWeinan,SONGPu,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the killing mechanism of CD8+T cells to melanocytes in the patients with vitiligo. Methods: CD8+T cells were obtained from peripheral blood in 8 patients with vitiligo and 8 healthy controls. The primary melanocyte, immortalized normal melanocyte cell line PIG1 and immortalized vitiligo melanocyte cell line PIG3V were co-cultivated with selected CD8+T cells respectively. The number of the death of melanocytes killed by CD8+T cells was assessed by Flow cytometry. The expression levels of IFN-γ, TNF-α, granzyme B and perforin were measured by ELISA. Results: The number of died primary melanocytes and PIG3V killed by CD8+T cells, the expression level of IFN-γ, granzyme B and perforin in the patients with vitiligo was higher than those in controls. There was no significant difference in the number of died PIG1 and the expression level of TNF-α between the patients and healthy controls. There was an obviously positive correlation between the level of IFN-γ secreted by CD8+T cells and the number of died melanocytes killed by CD8+T cells. Conclusion: The killing of melanocytes by CD8+T cells plays an important role in the development of vitiligo, which probably depends on the increased expression of IFN-γ, granzyme B and perforin.

vitiligo; CD8+T cells; IFN-γ; granzyme B; perforin

國家自然科學基金資助項目(編號：81502717, 81602764, XJZT15M10)

第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn