張宇萍 唐增奇 王亮春

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·論著·

抗Galectin-3抗體在皮膚血管炎中的表達(dá)

張宇萍 唐增奇 王亮春

目的： 檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、蕁麻疹性血管炎(UV)、過敏性紫癜(HSP)和變應(yīng)性皮膚血管炎(LCV)患者血清抗Galectin-3抗體的水平。方法： ELISA法檢測(cè)15例伴發(fā)皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE、13例UV、15例HSP和8例LCV患者血清及15例正常人血清(陰性對(duì)照)抗Galectin-3抗體水平。結(jié)果： SLE和UV患者血清中抗Galectin-3抗體吸光度值分別為：0.89±0.08、0.71±0.05，顯著高于對(duì)照組的0.46±0.02(P<0.05)；HSP和LCV患者中分別為0.60±0.05和0.60±0.04，與正常人相比無明顯差異。結(jié)論： 有皮損的蕁麻疹性血管炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮膚血管炎可能與血清中抗Galectin-3抗體升高有關(guān)。

蕁麻疹性血管炎； 過敏性紫癜； 變應(yīng)性皮膚血管炎； 抗Galectin-3抗體

皮膚血管炎是一組主要以血管壁腫脹、纖維素樣變性以及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤為組織病理特點(diǎn)的疾病，可以局限于皮膚，也可以同時(shí)伴發(fā)系統(tǒng)性損害。臨床上較常見的類型有蕁麻疹性血管炎(Urticarial Vasculitis，UV)、過敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)、變應(yīng)性皮膚血管炎(Leukocytoclastic Vasculitis，LCV)；最常見的伴發(fā)皮膚血管炎的系統(tǒng)性疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)[1,2]。這幾種皮膚血管炎，血管周圍浸潤細(xì)胞都以中性粒細(xì)胞為主，病理上統(tǒng)稱為中性粒細(xì)胞碎裂性血管炎，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與免疫復(fù)合物介導(dǎo)的三型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)廣泛存在人體各個(gè)組織器官中，作為功能性蛋白，其在腫瘤細(xì)胞的增殖分化、粘附遷移以及腫瘤轉(zhuǎn)移中有重要作用。該蛋白在SLE患者腎臟中也有豐富表達(dá)[3]。我們?cè)芯堪l(fā)現(xiàn)，伴有皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體水平明顯高于健康人，抗體滴度與皮損嚴(yán)重程度相關(guān)，且隨治療好轉(zhuǎn)而下降;從SLE患者血清中分離的抗Galectin-3抗體經(jīng)皮內(nèi)注射入小鼠體內(nèi)，可以引起類似于SLE皮膚血管炎的組織病理表現(xiàn)，充分提示該抗體在SLE皮膚血管炎的發(fā)生機(jī)制中有重要作用[4]。但是，抗Galectin-3抗體是否也與其他常見皮膚血管炎的發(fā)生有關(guān)還不清楚，因此，本研究主要通過分離和收集伴有皮損的不同類型皮膚血管炎患者的血清，以 ELISA方法檢測(cè)其中抗Galectin-3抗體的水平，并初步研究該抗體存在與皮膚血管炎發(fā)生之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 伴發(fā)皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE患者血清(陽性對(duì)照)15例，正常人血清(陰性對(duì)照)15例，有皮損的UV、HSP、LCV患者血清分別為13例、15例、8例。

1.2 主要試劑 Galectin-3蛋白購自Sino Biological公司；HRP標(biāo)記山羊抗人IgG購自Sigma公司；BSA購自Roche公司；TMB購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；2M 鹽酸購自汕頭市西隴化工廠有限公司；PBS購自博士德生物工程有限公司；吸光度檢測(cè)采用MULTISKAN MK3 ELISA檢測(cè)儀。

1.3 主要方法

1.3.1 收集血清 抽取患者及正常人晨起空腹靜脈血4 mL，3000 r/min離心10 min，吸取上層血清，EP管分裝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ELISA方法檢測(cè)樣本血清中的抗Galectin-3抗體水平[4]用PBS將Galectin-3蛋白濃度稀釋至1 μg/mL，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加入50 μL蛋白液，4℃條件下孵育過夜；PBST洗5遍，用2% BSA于37℃條件下溫育1h；PBST洗5遍，每孔加入稀釋比為1∶500的血清標(biāo)本100 μL，37℃溫育1 h；PBST洗5遍，加入濃度為1:3000的HRP-羊抗人IgG，室溫孵育1 h；PBST洗5遍，底物TMB顯色5 min，2M鹽酸終止反應(yīng)，在ELISA檢測(cè)儀上于450 nm處測(cè)吸光度(OD值)并記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析(one-way ANOVA)，各組之間數(shù)據(jù)多重比較用Dunn's檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者血清中抗Galectin-3抗體水平 如圖1所示，SLE患者和正常人血清中抗Galectin-3抗體OD值分別為0.89±0.08和0.46±0.02?？笹alectin-3抗體在SLE患者血清中顯著高于健康對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而我們前期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗Galectin-3抗體吸光度值在有皮損SLE患者和正常人分別為：0.75±0.39和0.40±0.32(P<0.05)。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前期結(jié)果一致[4]，一方面進(jìn)一步肯定了我們之前的發(fā)現(xiàn)，另一方面也保證了本次試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)技術(shù)的可靠性。

2.2 UV、HSP、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體水平 如圖1所示，UV、HSP、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體均高于正常人，OD值分別為：0.71±0.05，0.60±0.05和0.60±0.04，但僅有UV患者血清中抗Galectin-3抗體水平較健康對(duì)照組是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

正常人(15例)；SLE(15例);HSP(15例);UV(13例); LCV(8例); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

圖1 有皮損的SLE、HSP、UV、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體的水平

3 討論

Galectin-3蛋白可表達(dá)在細(xì)胞核、胞漿或胞膜上，也可以被分泌至循環(huán)系統(tǒng)中，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、加速細(xì)胞周期、調(diào)控細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄等功能[5，6]?？笹alectin-3抗體在一些自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生過程中有重要作用。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，有皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體明顯高于正常人，且與皮損嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示抗Galectin-3抗體在SLE皮損發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用[4]。另外，一些腸道自身免疫性疾病如克羅恩病患者血清中抗Galectin-3抗體滴度也顯著高于正常人，并且與疾病活動(dòng)性相關(guān)[7]。還有，國外也有研究將抗Galectin-3抗體用于治療多發(fā)性骨髓瘤及卵巢腫瘤，并取得了不錯(cuò)的成果，提示該抗體在腫瘤發(fā)生中也有重要作用[8]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)UV患者血清中抗Galectin-3抗體的滴度高于健康對(duì)照組，提示血清抗Galectin-3抗體升高不僅見于有皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE患者，也可以出現(xiàn)在有皮損的UV患者。眾所周知，SLE發(fā)病機(jī)制主要是免疫調(diào)節(jié)失常及外界等因素綜合作用于遺傳易感人群，從而產(chǎn)生大量自身抗體、免疫復(fù)合物及炎癥細(xì)胞、炎癥因子，導(dǎo)致皮膚、腎臟、肺臟等多臟器損害[9]。在前期研究中，我們還通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)皮內(nèi)注射抗Galectin-3抗體可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)皮膚血管炎的表現(xiàn)[4]。既往研究證實(shí)免疫復(fù)合物的形成和沉積是導(dǎo)致UV疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，免疫復(fù)合物沉積于血管壁，通過激活補(bǔ)體從而導(dǎo)致局部血管性水腫、缺血、壞死等血管炎性表現(xiàn)，但是參與該病理過程的致病性抗體和靶抗原尚不清楚[10，11]。因此，血清中抗Galectin-3抗體水平升高可能是引起UV患者皮損病變的原因之一，其血清水平升高與蕁麻疹性血管炎的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。與此同時(shí)，在我們的研究中，伴有皮膚血管炎表現(xiàn)的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體滴度較正常人明顯升高，但在UV患者中升高程度并不如前者。Her MY及Roy K等[12，13]的研究也發(fā)現(xiàn)，UV中的一部分患者，尤其是伴有低補(bǔ)體表達(dá)的患者，在隨訪過程中演變成為SLE，提示外周血中抗Galectin-3抗體明顯升高的UV患者有演變成SLE的趨勢(shì)，而HSP、LCV則基本不會(huì)演變成SLE，這為我們進(jìn)一步追蹤UV患者是否會(huì)演變至SLE，以及觀察其診斷是否準(zhǔn)確、治療是否合適提供了一定的借鑒意義。

值得注意的是，UV、HSP、LCV作為皮膚科三種常見的皮膚血管炎，目前其病因尚不明確。大約有45%～55%的皮膚血管炎患者屬于特發(fā)性發(fā)病，其他病因主要包括感染(15%～15%)、炎性疾病(15%～20%)、藥物(10%～15%)、腫瘤(<5%)等[14]。而在皮膚病理表現(xiàn)上，這三種皮膚血管炎均可見毛細(xì)血管、微靜脈等小血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤。在臨床工作中，皮膚血管炎診斷的重要依據(jù)是臨床及病理表現(xiàn)。如這三種疾病臨床表現(xiàn)不典型，而病理未見明顯改變或機(jī)體狀態(tài)不允許行皮膚病理活檢，鑒別診斷就成為一個(gè)相當(dāng)困難的問題。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，只有伴有皮損表現(xiàn)的UV患者血清中抗Galectin-3抗體水平明顯高于健康對(duì)照組，由此，血清抗Galectin-3抗體可能成為UV的相對(duì)特異的生物標(biāo)志物，有助于UV的診斷。當(dāng)然，本次試驗(yàn)的局限性在于，樣本的例數(shù)相對(duì)較少，期望將來能有更多的患者參與大樣本研究，以充分肯定上述結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了有皮損的UV患者血清中抗Galectin-3抗體滴度較正常人升高，可能在UV患者發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

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(收稿：2017-02-07)

Detection of serum anti-galectin-3 antibody in the patients with cutaneous vasculitis

ZHANGYuping,TANGZengqi,WANGLiangchun.

DepartmentofDermatology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

WANGLiangchun,E-mail:wliangch@mail.sysu.edu.cn

Objective: To detect the level of the serum anti-Galectin-3 antibody in the patients with systemic lupus erythematosus (SLE), urticarial vasculitis (UV), Henoch-Sch?nlein purpura (HSP) and leukocytoclastic vasculitis (LCV). Methods: The level of serum anti-Galectin-3 from 15 patients with SLE, 13 with UV, 15 with HSP, 8 with LCV and 15 healthy controls was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The values of optical density (OD) of anti-Galectin-3 antibody in the patients with SLE and UV were 0.89±0.08 and 0.71±0.05 respectively, which were significantly higher than those in the healthy controls (0.46±0.02) (P<0.05). There was no significant difference in the level of anti-Galectin-3 antibody among the patients with HSP (0.60±0.05), LVC (0.60±0.04) and healthy controls. Conclusion: Serum level of anti-Galectin-3 antibody was associated the cutaneous vasculitis in the patients with UV and SLE.

urticarial vasculitis; Henoch-Sch?nlein purpura; leukocytoclastic vasculitis; anti-Galectin-3 antibody

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東廣州,510120

王亮春， E-mail: wliangch@mail.sysu.edu.cn