夏清 嚴沛元 謝小軍 董帥

CK19對橋本甲狀腺炎伴發(fā)多灶性甲狀腺乳頭狀癌的預測價值

夏清 嚴沛元 謝小軍 董帥

目的 探討細胞角蛋白（CK19）對橋本甲狀腺炎（HT）伴多灶性甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的預測指標。方法 根據(jù)病理檢查結果選擇HT合并多灶性PTC（A組）、HT合并單發(fā)PTC（B組）、單純HT（C組）各30例，觀察并分析其術前酶標免疫分析法測定的血清CK19水平及免疫組化方法檢測的病理標本CK19表達情況。結果 A、B兩組和B、C兩組患者血清CK19表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。病理標本CK19免疫組化結果A組呈強陽性，B組呈陽性，C組呈弱陽性，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。 結論 HT伴多灶性PTC患者CK19免疫組化陽性表達水平，明顯高于HT伴單發(fā)PTC患者，對術前穿刺或術中標本CK19免疫組化呈強陽性表達者應考慮行甲狀腺全切術。

細胞角蛋白19 橋本甲狀腺炎 甲狀腺乳頭狀癌

橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）癌變問題是近年來臨床研究的熱點之一，有關發(fā)病的許多機制尚未明確，且治療方案也仍存在爭議。有學者主張對此類患者一律行甲狀腺全切除術，但有研究表明甲狀腺全切術后永久性甲狀旁腺功能減低和喉返神經損傷的發(fā)生率較高[1]。因此，臨床上一般認為HT伴單發(fā)小癌灶可行單側腺葉切除術，但目前尚無明確指標能預先判斷HT伴發(fā)的是單發(fā)癌還是多灶癌，如確定為HT伴多灶性甲狀腺乳頭狀癌（PTC），應行甲狀腺全切術。術前B超檢查有一定的局限性，術中冷凍切片也只是把比較明顯的結節(jié)進行快速病理檢查，往往會遺漏微小癌灶，因此進行HT多灶性癌變預警信號的研究對指導臨床治療方案具有重要意義。研究證實，細胞角蛋白19（CK19）在所有的PTC中都表達，作為PTC標記的靈敏度達到100%，特異度達到82.15%[2]。典型PTC中CK19多呈強陽性表達，濾泡型乳頭狀癌與混合較多濾泡結構的PTC多呈中等或稍強陽性表達，直徑＜1cm的隱匿性PTC及甲狀腺內微小轉移灶也呈彌漫性陽性表達，癌旁組織、腺瘤、結節(jié)性甲狀腺腫及乳頭狀增生均呈陰性或小灶性陽性表達，提示CK19有助于PTC的診斷，可用于隱匿性PTC與良性結節(jié)的鑒別診斷及判斷甲狀腺組織內是否存在微小轉移灶。但CK19在HT伴多灶性或單發(fā)PTC中的表達是否有差異，能否作為前者的預警信號尚未見報道，對此筆者進行了研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 根據(jù)術后病理檢查結果，選取2013年6月至2015年6月在浙江省人民醫(yī)院及浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院手術治療的HT伴多發(fā)性PTC（A組）、HT伴單發(fā)（B組）及單純HT（C組）患者各30例。A組男6例，女24例，平均年齡（46.00±7.25）歲，＜45歲11例（占36.67%），≥45歲19例（占63.33%）；B組男8例，女22例，平均年齡（49.00±6.89）歲，＜45歲9例（占30.00%），≥45歲21例（占70.00%）；C組男10例，女20例，平均年齡（50.00±5.77）歲，＜45歲8例（占26.67%），≥45歲22例（占73.33%）。3組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。納入標準：所有因具備甲狀腺手術指征行手術治療而術后病理證實為HT伴PTC或單純HT的患者。排除標準：有甲狀腺功能亢進、亞急性甲狀腺炎病史、結核病史或有其他惡性腫瘤病史、免疫功能低下、其他重大疾病史，術前曾行化療、放療或免疫治療史的患者。所有患者均為體檢彩超檢查發(fā)現(xiàn)甲狀腺結節(jié)因懷疑惡性或因結節(jié)較大有癥狀而行手術治療，術前均采集血液樣本進行化驗，所有患者均經病理診斷證實。根據(jù)術后病理結果將其分為A組（HT合并多灶性PTC）、B組（HT合并單發(fā)PTC）、C組（單純HT），每組30例。

1.2 主要試劑 CK19試劑盒購自美國RB公司；CK19抗體購自美國Santa Cruz Bio公司；DAB顯色試劑盒（20×）購自北京CWbio公司；PBS（pH7.5，10×）購自北京CWbio公司；中性樹膠購自北京CWbio公司；改良型蘇木素購自北京CWbio公司；二甲苯購自北京化學試劑公司；無水乙醇購自北京化學試劑公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清CK19水平的測定 所有患者均術前禁食12h后采血，清晨空腹抽取肘靜脈血3ml。室溫下靜置30min后，2 000r/min離心15min，分離血清，取1.5ml放置在-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫醒褰y(tǒng)一編號，各項指標均統(tǒng)一標準。實驗采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定血清CK19水平。先將微孔板用純化的抗體包被，制成固相抗體，然后向包被單抗的微孔中按順序加入CK19抗原、生物素化的抗人CK19抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。在過氧化物酶的催化下，TMB轉化為藍色，最后在酸的作用下轉化為黃色。顏色深淺與血清CK19濃度呈正相關。在450nm的波長下，用酶標儀測定吸光度（OD值），將標準物濃度作為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值作為縱坐標(普通坐標),然后在半對數(shù)坐標紙上畫出標準曲線。由血清樣本的OD值根據(jù)標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度。

1.3.2 病理標本CK19免疫組化法檢測 60℃烤片1h，二甲苯脫蠟2次，每次5min；二甲苯與純乙醇（1∶1）混合2min，再按順序浸入梯度乙醇（純乙醇－純乙醇－95%乙醇－85%乙醇－75%乙醇）及蒸餾水中，每次2min水化；用內源性過氧化物酶封閉10min，然后PBS洗凈；用蛋白非特異性結合位點封閉10min，然后PBS洗凈；用0.1%Triton在冰上孵育 15min，然后 PBS洗凈；用0.125%胰酶在室溫下孵育30min，然后PBS洗凈；用冷0.1mol/L鹽酸孵育30min除去染色體的組蛋白，然后PBS洗凈；用2mol/L鹽酸在室溫下孵育35min，使DNA雙鏈解開，然后PBS洗凈；用0.1mol/L四硼酸鈉在室溫下孵育20min，然后PBS洗凈；用一抗（鼠抗人CK19單克隆抗體）工作液孵育36h，然后PBS洗凈；用二抗（羊抗鼠IgG）工作液孵育RT 30min，然后PBS洗凈；用Streptavidin-HRP工作液孵育RT 30min，然后PBS洗凈。DAB顯色：采用DAB顯色試劑盒（20×），用現(xiàn)配的DAB工作液顯色2～7min，然后在顯微鏡下觀察，控制顯色時間。蘇木素復染：采用改良型的蘇木素，復染1～ 3min，然后PBS沖洗返藍；用1%鹽酸分化液分化10s，然后PBS沖洗返藍。用75%－85%－95%－100%－100%各濃度乙醇每種3min逐級脫水，二甲苯與純乙醇（1∶1）混合5min，用二甲苯浸沒2次，每次5min，然后加中性樹脂將蓋玻片封片，晾干。最后用顯微成像系統(tǒng)拍照，對比圖像結果，染色強度以陽性細胞＜25%為+，陽性細胞25%～50%為++，陽性細胞51%～75%為+++，陽性細胞＞75%為++++；廣泛深染（+++～++++）為強陽性，中度染色（+～++）為陽性，低度染色（＜+）為弱陽性。用國際通用的IPP（image pro plus）軟件（美國Media Cybernetics）進行平均光密度定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 3組患者血清CK19表達水平的比較 CK19表達水平以HT合并多灶性PTC組為高，HT合并單發(fā)PTC組居中，單純HT組低，但3組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患者血清CK19表達水平的比較（ng/ml）

2.2 3組標本CK19免疫組化檢測結果

2.2.1 3組標本鏡下所見 免疫組化檢測結果顯示A組CK19表達呈強陽性（+++～++++），B組CK19表達呈陽性（+～++），C組CK19表達呈弱陽性（＜+），見圖1。

圖1 3組標本CK19免疫組化檢查結果（SP法×40）

2.2.2 3組標本平均光密度定量分析結果比較 C組密度最低，與A、B組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。A組平均光密度明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組標本平均光密度定量分析結果比較

2.3 CK19表達水平與PTC淋巴結轉移的關系 A、B兩組CK19陽性表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在頸部中央區(qū)淋巴結轉移陽性的患者中CK19免疫組化強陽性表達比例明顯高于轉移陰性的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但在單獨A或B組中差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），血清CK19水平差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 CK19表達水平與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移的關系[例（%）]

3 討論

HT伴發(fā)甲狀腺癌主要是PTC，且往往為多灶性PTC。近年來HT伴發(fā)PTC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。研究表明，HT伴發(fā)TC的發(fā)生率為12%，絕大多數(shù)為PTC，HT與PTC的發(fā)生關系密切[3-5]，HT伴有甲狀腺功能減退的甲狀腺結節(jié)，其惡變的可能性會大大增加。HT伴發(fā)PTC應手術治療，但目前對手術范圍的意見尚不一致，國外有些學者認為HT是癌前病變，患側切除后，對側腺體有2%～9%的概率會出現(xiàn)甲狀腺癌復發(fā)，所以他們主張行甲狀腺全切術；但也有學者提出，甲狀腺全切術后出現(xiàn)的永久性甲狀旁腺功能減低及喉返神經損傷的發(fā)生率較單側切除術明顯要高[6]。HT伴單發(fā)的小癌灶可行單側腺葉切除術，如確定HT伴發(fā)多灶性PTC則應行甲狀腺全切術，但目前尚無明確指標能預先判斷HT伴發(fā)的是單發(fā)癌灶還是多灶癌。多發(fā)病灶是甲狀腺癌、尤其是PTC的臨床特征之一。多灶性PTC與淋巴結轉移、遠處轉移及局部復發(fā)相關，多發(fā)癌灶可增加淋巴轉移、遠處轉移及術后復發(fā)的風險[7]，本研究也表明多灶癌的淋巴轉移陽性率明顯高于單發(fā)癌。但目前對于多灶性PTC的診斷，只有在術中或術后經病理切片證實，而術中冰凍切片只是針對較為明顯的結節(jié)，往往會遺漏其它微小癌灶。但如果都把雙側甲狀腺全部切除進行病理檢查則會使許多單發(fā)癌患者接受了過度治療，且增加了手術并發(fā)癥的發(fā)生率。因此，如能結合術前或術中檢查對多灶性PTC進行預判將有助于選擇手術方式，對指導臨床治療方案具有重要意義。

CK屬于中微絲蛋白家族,是上皮細胞骨架的組成部分,在正常上皮、上皮源性原發(fā)腫瘤及其轉移瘤細胞上表達。CK19分子量為40kD，其分子量較低，由KRT19基因編碼，主要表達于正常上皮及各種上皮來源的腫瘤中，尤其是單層上皮和間皮；成人皮膚、肝細胞及角膜表達陰性，而子宮上皮、羊膜上皮及間質則呈陽性表達，主要用于腺癌的診斷。近年來，CK19在甲狀腺疾病的研究中被廣泛采用，國內外均有許多研究。CK19是目前常用的PTC診斷免疫標志物之一，其彌漫強陽性表達有助于PTC的診斷，可用于隱匿性PTC與良性結節(jié)的鑒別診斷及判斷甲狀腺內是否存在微小轉移灶。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，CK19的高表達能提高PTC診斷的特異性。HT中淋巴濾泡周圍甲狀腺濾泡上皮有陽性表達，癌變組織中的陽性率為100%，且強而廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，HT濾泡上皮增生、不典型增生、癌變，CK19的陽性表達會逐漸增強，CK19在HT中的高表達，特別是在不典型增生細胞中的高表達，提示其有可能發(fā)展為PTC，可作為早期檢測HT向PTC癌變的指標之一[9]。Cochand-Priollet等[10]發(fā)現(xiàn)，與形態(tài)學方法相比，CK19抗體染色能夠減少PTC診斷的假陽性率和假陰性率，從而提高診斷的準確性，減少不必要的手術治療。另外在PTC患者當中,伴有淋巴結轉移的患者CK19表達水平又高于沒有淋巴結轉移的。本研究結果表明，檢測血清CK19水平因各組無統(tǒng)計學差異故認為其對預測是否為HT伴多灶癌沒有幫助，對預測是否有淋巴結轉移亦無幫助，而CK19免疫組化檢測則有助于預測是否為HT伴多灶性PTC，而且對預測PTC淋巴結轉移也具有一定的意義。本研究表明，HT伴多灶性PTC組CK19免疫組化呈強陽性表達，明顯高于HT伴單發(fā)PTC組，故可作為預測HT伴多灶性PTC的指標，如術前穿刺或術中標本進行CK19免疫組化檢測呈強陽性表達則提示很有可能為HT伴多灶性PTC，結合術中冷凍切片建議行甲狀腺全切；另外頸部中央區(qū)淋巴結轉移陽性組的CK19強陽性表達（+++～++++）率明顯高于淋巴結轉移陰性組，而淋巴結轉移陽性組的CK19陽性（+～++）表達率則明顯低于淋巴結轉移陰性組，提示如CK19強陽性表達則很有可能中央區(qū)淋巴結轉移為陽性，須行淋巴結清掃。

總之，HT與PTC的發(fā)生有非常密切的關系，而是否為多灶癌則直接關系到手術方式及預后。本研究發(fā)現(xiàn)HT伴多灶性PTC的組織中CK19呈強陽性表達，明顯高于HT伴單發(fā)PTC，因此可以利用免疫組化檢測CK19水平來預測是否為HT多灶性癌變，對于HT伴PTC的臨床診斷治療具有重要的指導作用。

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Predicting value of CK19 in Hashimoto's thyroiditis patients complicated w ith multifocal papillary thyroid carcinoma

XIA Qing,YAN

Peiyuan,XIE Xiaojun,et al.Department of Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the serum level and tissue exp ression of CK19 in Hashimoto's thyroid itis(HT) com p licated w ith multifocal pap illary thyroid carcinoma(PTC). Methods Ninety patients pathologically d iagnosed as HT w ith multifocalPTC(g roup A,n=30),HTw ith unifocalPTC(g roup B,n=30)and HT only(group C,n=30)adm itted in two hospitals from June 2013 to June 2015 were enrolled in the study.The CK19 levels in serum were determ ined by ELISA and the exp ression of CK19 in tissue sections was detected by immunohistochem istry. Results There was no significant d ifference in serum CK19 levels between g roups A and B,between g roups B and C(P＞0.05).The exp ression ofCK19 in tissue specimens ofg roup A was stronger than that in g roup B(0.007536±0.003851 vs 0.005126±0.006244,P＜0.05),and the latterwas stronger than thatof C g roup(0.005126±0.006244 vs 0.003444±0.002063,P＜0.05). Conclusion Tissue exp ression of CK19 in HT patients w ith multifocal PTC is higher than that in HT patients w ith unifocal PTC or in patients w ith HT alone,which suggests that strong ly positive exp ression ofCK19 in biopsy specimensmay ind icate HTw ithmultifocalPTC.

CK19 Hashimoto's thyroid itis Papillary thyroid carcinoma

2016-12-17）

（本文編輯：嚴瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-2108

浙江省衛(wèi)計委資助項目（2014KYA059）

310014杭州，浙江省人民醫(yī)院干部科（夏清、嚴沛元）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院甲狀腺疾病診治中心（謝小軍、董帥）

董帥，E-mail：donshai@163.com