李冰潔

摘要：目的 探討撫順市2014年手足口?。℉FMD）相同來源腸道病毒71型分離株（EV71）的VP1區(qū)基因特征。方法 從2014年手足口患者20份咽拭標(biāo)本中進(jìn)行EV71病毒分離，隨機(jī)挑取2株分離株經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增VP1區(qū)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列分析，構(gòu)建2株分離株與各代表株間的基因親緣性進(jìn)化樹。結(jié)果 在對2株EV71進(jìn)行VP1區(qū)基因測定顯示：與C4亞型代表株的核苷酸序列同源性較高，在親緣進(jìn)化樹上，屬于C4基因亞型進(jìn)化分支。結(jié)論 從HFMD患者中分離出的EV71為C4基因亞型進(jìn)化分支，在親緣性進(jìn)化樹中為緊密相連的一小簇，呈單源進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：腸道病毒EV71型；手足口病；基因特征

Analysis of Genotype of VP1 Region of Enterovirus 71 in Fushun City， 2014

LI Bing-jie

（Fushun City Health School，F(xiàn)ushun 113006，Liaoning，China）

Abstract：Objective To investigate the VP1 gene characteristics of enterovirus 71 isolate（EV71），the same source of HFMD in Fushun City，2014. Methods The EV71 virus was isolated from 20 swallow specimens of hand，foot and mouth in 2014.Two VP1 isolates were amplified by RT-PCR and the amplified products were analyzed by nucleotide sequence analysis.Two isolates were constructed Gene-related phylogenetic trees between the plant and the representative.Results The VP1 gene of two EV71 showed that the nucleotide sequence of C4 subtype was higher than that of C4 subtype，and belonged to C4 subtype evolutionary branch in kinship phylogenetic tree.Conclusion EV71 isolated from HFMD patients is an evolutionary branch of C4 gene subtype，and it is a small cluster closely connected in phylogenetic tree，showing a single evolutionary relationship.

Key words：Enterovirus EV71；Hand，foot and mouth disease；Genetic characteristics

腸道病毒71型（EV71）在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，主要通過人群間的密切接觸傳播，也可經(jīng)消化道傳播，引起手足口?。℉FMD）、類脊髓灰質(zhì)炎腦炎等疾病。尤其是手足口病，由于其傳染性強(qiáng)、傳播速度快、兒童病死率較高等特征，因此備受重視[1]，被列為國家法定傳染病，并且近幾年也已引起社會廣泛的重視。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在丙類傳染病中，HFMD報(bào)告發(fā)病數(shù)和報(bào)告死亡數(shù)均已躍居前位。為了解撫順市手足口病基因特征，于2014年對HFMD患兒的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行鑒定及EV71病毒進(jìn)行了深入分析與探討。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本 采集撫順市某醫(yī)院2014年6月～9月臨床診斷為HFMD的20例患兒的咽拭子標(biāo)本，裝入特定采集管中，-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2病毒分離鑒定 將發(fā)病3 d內(nèi)的咽拭子標(biāo)本分別接種于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞和非洲綠猴腎細(xì)胞中，每份標(biāo)本在兩種細(xì)胞中各接種3管，每天觀察細(xì)胞病變，連續(xù)培養(yǎng)7 d，并至少傳2代，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變后，則使用熒光定量PCR（Real time-PCR）方法進(jìn)行鑒定。

1.3病毒RNA核酸提取 取收獲的病毒上清液，使用核酸提取儀，應(yīng)用 Minibest Viral RNA Kit（TAKARA，Cat，No： DV818A）按照說明書進(jìn)行提取病毒核酸。

1.4病毒核酸PCR熒光檢測 應(yīng)用腸道病毒EV71核酸試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Real time-PCR方法檢測，在PCR儀上進(jìn)行熒光定量分析。

1.5 RT-PCR法擴(kuò)增EV71病毒VP1區(qū) VP1區(qū)引物序列設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn)[2]，用全長VP1區(qū)基因片段EV71VP1F和EV71VP1R作為引物，在此擴(kuò)增引物基礎(chǔ)上進(jìn)行RT-PCR，其反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min、93 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min，經(jīng)35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，轉(zhuǎn)入4 ℃ 10min，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為1015 bp，并對腸道病毒EV71的VP1區(qū)進(jìn)行核酸序列測定。

1.6 EV71VP1區(qū)核苷酸序列測定和分析 用QIAquick Gel Extraction Kit[3]試劑盒進(jìn)行純化，并對測序的產(chǎn)物標(biāo)記，在ABI-310型核苷酸自動測序分析儀上檢測，所得結(jié)果用MEGA4構(gòu)建進(jìn)化樹，采用NCBI的GenBank的數(shù)據(jù)庫對比分析。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 對所采集的20份標(biāo)本用 Real time-PCR檢測方法進(jìn)行腸道病毒EV71型檢測，檢測結(jié)果是其中9份標(biāo)本的CT值小于35，可以確定為EV71陽性標(biāo)本。

2.2病毒的常規(guī)分離 我們采用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD）和非洲綠猴腎細(xì)胞（VERO）兩種細(xì)胞做病毒分離，將所采集的9份陽性標(biāo)本分別加入細(xì)胞中，每份標(biāo)本在三種細(xì)胞上至少傳三代，共觀察21 d。其中有8份標(biāo)本在VERO細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的CPE，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、變圓、聚集成葡萄串狀的病變；5份標(biāo)本在RD細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的CPE，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓脫落的病變。通過用兩種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，我們共分離出了8份陽性病毒液，其中有5份標(biāo)本在RD和VERO細(xì)胞上都有病變，3份標(biāo)本只在VERO細(xì)胞上有病變，說明對腸道病毒EV71型，VERO細(xì)胞更為敏感。

2.3分離株的RT-PCR檢測 從8份陽性標(biāo)本中提取病毒DNA，用EV71病毒VP1區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條帶經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，片段大小在1056 bp左右，條帶清晰無雜帶[4]，PCR擴(kuò)增片段經(jīng)TA克隆并進(jìn)行測序。將病毒序列在GenBank中用Blastn進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與C4亞型代表株具有最高的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性，因此8株病毒為腸道病毒EV71行C4亞型。

2.4腸道病毒EV71型的進(jìn)化樹分析 分離株EV71型的VP1區(qū)核苷酸序列長度均為891個核苷酸，編碼297個氨基酸。VP1區(qū)核苷酸分為A、B、C三個基因型[3]，其中B又可分B1 B4基因亞型、C分為C1 C4四個亞型。在GenBank中檢索表明：隨機(jī)選取的2株EV71分離與C4亞型代表株的核苷酸序列同源性較高，在親緣進(jìn)化樹上，屬于C4基因亞型進(jìn)化分支，為2014年流行株的分子流行病學(xué)特征。其構(gòu)建的2株分離株與各代表株間的基因親緣性進(jìn)化樹（見圖1）。

3 討論

全球最早報(bào)道手足口病流行的國家為新西蘭，隨后陸續(xù)在其它國家和地區(qū)均有此病的報(bào)道。近年來，隨著疾病的流行，我國學(xué)者對腸道病毒EV71基因型的研究也逐漸深入，如呂莉琨等人對天津地區(qū)引起的HFMD已進(jìn)行了分子流行病學(xué)的研究，尤其是2008年阜陽市引起HFMD爆發(fā)疫情后，引起了社會的廣泛關(guān)注，對EV71的分子流行病學(xué)研究也越來越多，而研究的重點(diǎn)集中在VP1區(qū)基因序列分析上，VP1基因具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性[5]，可作為腸道病毒屬內(nèi)血清型分類依據(jù)。根據(jù)VP1核苷酸序列的差異，將EV71分為A、B、C3個基因型，B型又細(xì)分為B1～B5[6]，C型細(xì)分為C1～C5，是我國主要流行株，也是2014年撫順市HFMD疫情的流行株。

通過構(gòu)建種系進(jìn)化樹模型，分離得到的2株分離株與C4亞型連接為一小簇，并且與A、B基因型在遺傳點(diǎn)位上相距較遠(yuǎn)，說明2株分離株均為C4亞型，這與呂莉琨等人的研究相似[7]，并與中國大陸目前流行的EV71的優(yōu)勢基因亞型一致[8]；其次，2個樣本在進(jìn)化樹構(gòu)建中密切相連，簇狀排列，屬于單源進(jìn)化。

EV71感染是對兒童威脅性較大的病毒性疾病之一，每年都有兒童因感染EV71而死亡的報(bào)道，盡管臺灣及鄰近的國家均報(bào)道有多種基因型、亞型的流行，但中國大陸報(bào)道的流行株仍以C4亞型為主，病毒變異不大，由于EV71對VERO細(xì)胞敏感，VERO細(xì)胞是WHO推薦的可以用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞，其安全性在疫苗生產(chǎn)中已經(jīng)得到了充分的驗(yàn)證，這就為EV71疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，目前我國已經(jīng)研制出了EV71疫苗，并在臨床上已經(jīng)加以應(yīng)用，這種對兒童威脅性較大的病毒性疾病今后一定會得到有效的控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉佳，夏瑪麗，黃江河，等.2013年克拉瑪依市手足口病EV71型VP1基因特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，1（25）：238-244.

[2]龔黎明，葛瓊，嚴(yán)菊英，等.浙江省腸道病毒71型的分離與VP1區(qū)域序列分析[J].中華流行病雜志，2005，26（12）：971-974.

[3]于偉，姚文清，陳靜乙.遼寧省2008年-2009年腸道病毒71型VP1區(qū)基因特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，4（21）：987-992.

[4]張眉眉，于偉，孫海波，等.遼寧省首株人腺病毒14型的分離與鑒定[J].疾病監(jiān)測，2014，9（29）：684-687.

[5]邵強(qiáng)，楊全中，馮真真，等.腸道病毒71型安徽、河南株的分離與VP1區(qū)序列進(jìn)化分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，3：150-154.

[6]付建軍，王海峰，馬超峰，等.西安市手足口病腸道病毒71型分離株VP1區(qū)基因特征分析 [J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2014，9（16）：1363-1365.

[7]呂莉琨，李力，李佳萌，等.天津地區(qū)腸道病毒71型的分子特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，10（19）：2236-2239.

[8]范麗霞，巴卓瑪，冀天驕，等.2012年青海省腸道病毒71型VP1區(qū)基因特征分析[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2013，4（29）：361-363.

編輯/錢洪飛