萬云雷，韓紅霞，李 利，伍瀟潔，高夢祥,2,*

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.長江大學(xué)荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州 434025）

低頻磁場對紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的影響

萬云雷1，韓紅霞1，李 利1，伍瀟潔1，高夢祥1,2,*

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.長江大學(xué)荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州 434025）

探討低頻磁場處理對紫色紅曲菌（Monascus purpurcus）發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的影響，確定最佳處理?xiàng)l件。分別研究低頻磁場強(qiáng)度、處理時(shí)間和處理時(shí)期對紫色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的影響規(guī)律，探討在最佳處理?xiàng)l件下，磁場對紫色紅曲霉麥角固醇代謝過程的影響和紫色紅曲霉的生物量在整個(gè)發(fā)酵周期的變化，及對紫紅曲霉其他主要代謝物的影響。結(jié)果表明：低頻磁場處理紫色紅曲菌的最適條件為磁場強(qiáng)度1.2 mT、處理時(shí)間2 d、處理時(shí)期在發(fā)酵0～2 d，在發(fā)酵第12天，麥角固醇產(chǎn)量達(dá)到了7.08 mg/g，生物量達(dá)到3.2 g/L ，比對照組分別增加了62.5%和31.68%。低頻磁場是提高紫色紅曲菌生產(chǎn)麥角固醇產(chǎn)量的有效手段，研究為低頻磁場輔助微生物發(fā)酵，提高有益產(chǎn)物的合成提供了數(shù)據(jù)支持。

低頻磁場；紫色紅曲菌；生物量；麥角固醇；液態(tài)發(fā)酵

麥角固醇（C28H43OH）是合成VD2、可的松、黃體酮的前體原料[1-2]，VD2對人體吸收鈣、磷有良好的促進(jìn)效應(yīng)，尤其是嬰幼兒、孕婦和老人[3]。近年來，微生物發(fā)酵法已經(jīng)成為生產(chǎn)麥角固醇的主要方法，其主要菌種有：酵母菌[4-5]、紅曲菌[6-7]、青霉[8]和黑曲霉[9]等。謝宗良等[10]采用誘變的酵母菌生產(chǎn)麥角固醇，產(chǎn)量達(dá)到0.34 g/L，比誘變前的菌株提高了11.5%。寧瑋霽等[11]發(fā)現(xiàn)了紅曲菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基里，其麥角固醇產(chǎn)量可達(dá)1 167.1 μg/g。譚艾娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在紅曲菌最佳液態(tài)發(fā)酵工藝條件下，其產(chǎn)麥角固醇產(chǎn)量可達(dá)747.6 μg/g。最近幾年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)低頻磁場（頻率低于300 Hz）可促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸鏈球菌肽的產(chǎn)量提高5 倍[13]，啤酒酵母產(chǎn)乙醇的量提高17%[14]，黏紅酵母生物量提高14%～28%，轉(zhuǎn)化酶的量提高48%～67%[15]，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的量和纖維素酶活性分別提高60%和30%[16]。本研究團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)了低頻磁場對紫色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵時(shí)生物量、培養(yǎng)基消耗[17]、色素[18]和γ-氨基丁酸合成[19]的影響規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究低頻磁場對紫色紅曲菌產(chǎn)麥角固醇的影響，為低頻磁場促進(jìn)紫色紅曲菌產(chǎn)物的合成提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紫色紅曲菌（Monascus purpurcus）由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蔗糖30 g、酵母膏5.0 g、瓊脂15 g、KCl 0.5 g、NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水定容1 000 mL，pH值自然。種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉 6 g、黃豆粉 0.5 g、KNO30.25 g、ZnSO40.05 g、MgSO40.05 g，蒸餾水定容1 000 mL，pH值自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g，pH值自然，蒸餾水定容1 000 mL，每支試管裝10 mL。以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃、25 min[20]。

乙腈（色譜純） 美國賽默飛世爾科技公司；麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；低頻磁場處理設(shè)備 自行設(shè)計(jì)研制。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將保藏紫色紅曲菌菌種活化后，接種于斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，再挑取斜面菌種，接種于種子培養(yǎng)基100 mL中，在150 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。等到種子液中孢子濃度大約為104個(gè)/mL時(shí)，將孢子液接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)11 d[21]。

1.3.2 磁場處理設(shè)備

低頻磁場處理設(shè)備為本研究團(tuán)隊(duì)自行設(shè)計(jì)研制，具體結(jié)構(gòu)和功能見文獻(xiàn)[18]。

1.3.3 磁場處理

將接種的發(fā)酵液，分別在不同磁場強(qiáng)度、處理時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間段進(jìn)行處理后，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至第11天，分離得到菌絲體，測定麥角固醇含量。

1.3.4 麥角固醇、γ-氨基丁酸、洛伐他汀和橘霉素產(chǎn)量測定[11,19-21]

采取分光光度法測定麥角固醇產(chǎn)量，稱取適量的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙醚，配制成0～20.00 μg/mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液在282 nm波長處的吸光度，得出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與其質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。樣品中麥角固醇含量的測定：將發(fā)酵液于4 000 r/min離心，至發(fā)酵液澄清，將沉淀物于40 ℃處理3～5 h，稱取一定烘干物（0.02 g左右）于50 mL離心管中，加入15 mL的300 g/L KOH溶液和5 mL的40%乙醇溶液，90 ℃水浴皂化3 h后冷卻至室溫，加入10 mL乙醚充分振蕩，靜置10 min，取乙醚層用95%酒精稀釋，在282 nm波長處測定溶液吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出浸提液質(zhì)量濃度，計(jì)算紅曲菌干菌絲的麥角固醇產(chǎn)量（mg/g）。

采取分光光度法測定γ-氨基丁酸產(chǎn)量，取1 mL發(fā)酵液，加入0.5 mL硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 10），搖勻，加入2 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%次氯酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置于沸水浴中10 min，待溶液變成藍(lán)綠色后，冷卻至室溫，加入2.0 mL 60%酒精，在640 nm波長處測定溶液的吸光度。

采取分光光度法測定洛伐他汀產(chǎn)量，將發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)入離心管中，勻漿機(jī)攪碎后，加入10 mL乙酸乙酯，完全混合后靜置分層，取上清液重復(fù)幾次至上清液無色為止，合并上清液，真空干燥儀45 ℃濃縮至干，用少許苯溶解干燥物，待苯溶液揮發(fā)后，再用95%乙醇溶液溶解至一定體積，在238 nm波長處測定溶液吸光度。

采用液相色譜測定橘霉素產(chǎn)量，取發(fā)酵樣品，濾紙過濾，取一定體積的發(fā)酵液，加入等體積的萃取液（甲苯-乙酸乙酯-甲酸體積比7∶3∶1），充分萃取，10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜測定其濃度，檢測條件：二極管陣列檢測器，檢測波長330 nm，流動相為 V（乙腈）∶V（水）=50∶50，水用磷酸調(diào)pH 2.5；流速1 mL/min。

1.3.5 紫色紅曲菌代謝麥角固醇的變化

在前期得出的最適處理?xiàng)l件下，在紫色紅曲菌整個(gè)發(fā)酵周期里，每隔2 d測定一次麥角固醇的含量，分別得到紫色紅曲菌在低頻磁場處理和未處理時(shí)的麥角固醇在不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)量。

1.3.6 紫色紅曲菌生物量的變化

在前期得出的最適處理?xiàng)l件下，在整個(gè)發(fā)酵周期里，每隔2 d用菌絲干重法測定發(fā)酵液中的生物量，分別得到紫紅曲菌在低頻磁場處理和未處理時(shí)的生長曲線。

1.3.7 最佳磁場處理?xiàng)l件對紫紅曲菌其他主要代謝產(chǎn)物的影響

根據(jù)上述合適的磁場處理強(qiáng)度、處理時(shí)間及處理周期對紅曲菌進(jìn)行培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)，測定其他主要代謝產(chǎn)物量的變化，并和對照組進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SAS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行成組數(shù)據(jù)等方差顯著性t檢驗(yàn)（磁場強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)，P＜0.05）和成對數(shù)據(jù)等方差顯著性t檢驗(yàn)（處理時(shí)間和處理時(shí)期實(shí)驗(yàn)，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長282 nm處的吸光度與其質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系，二者的回歸方程為：y=0.031 9x＋0.062 9，R2=0.999 3。

2.2 磁場強(qiáng)度對紫色紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的影響

圖 1 磁場強(qiáng)度對麥角固醇產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of magnetic field intensity on ergosterol production

麥角固醇產(chǎn)量隨磁場強(qiáng)度（紅曲菌發(fā)酵液處理11 d）的變化結(jié)果見圖1，可以看出，磁場強(qiáng)度為0.5 mT和1.2 mT時(shí)，都有促進(jìn)效應(yīng)，而磁場強(qiáng)度1.2 mT時(shí)，麥角固醇產(chǎn)量最高，并與對照和其他場強(qiáng)處理有顯著差異，磁場強(qiáng)度為0.6 mT時(shí)，對麥角固醇產(chǎn)量與對照相比沒有顯著性差異。磁場強(qiáng)度為1.6 mT和2.0 mT時(shí)均有顯著的抑制效應(yīng)。因此，選取1.2 mT為后期實(shí)驗(yàn)的磁場處理強(qiáng)度。

2.3 磁場處理時(shí)間對紫色紅曲菌麥角固醇產(chǎn)量的影響

將紅曲菌發(fā)酵液置于1.2 mT磁場強(qiáng)度，分別處理2、4、6 d和8 d，圖2呈現(xiàn)出各磁場處理均表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，且各處理組與其對照組的麥角固醇產(chǎn)量都有顯著差異。但處理2 d的促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)，處理組麥角固醇產(chǎn)量是對照組的1.65 倍。因此，確定處理2 d為最適磁場處理時(shí)間。

圖 2 磁場處理時(shí)間對麥角固醇產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of magnetic field exposure duration on ergosterol production

2.4 磁場處理時(shí)期對紫色紅曲菌麥角固醇產(chǎn)量的影響

圖 3 磁場處理時(shí)期對麥角固醇產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of fermentation stage when magnetic field exposure was performed on ergosterol production

將紅曲菌發(fā)酵液在1.2 mT的磁場強(qiáng)度，分別于發(fā)酵的不同時(shí)間段處理2 d，圖3顯示出處理組與對照組的麥角固醇產(chǎn)量在各處理時(shí)期都有所增加，而在0～2 d，增加效果最明顯，處理組麥角固醇產(chǎn)量是對照組的1.6 倍。0～2 d是紫色紅曲菌對數(shù)生長的前期，在這一時(shí)期，菌種開始大量繁殖，而麥角固醇位于菌絲體細(xì)胞膜中，因此，有利于菌繁殖也有利于麥角固醇的合成。也表明菌種在大量繁殖初期對外加磁場的反應(yīng)更敏感。麥角固醇是主要的酵母質(zhì)膜中的甾醇組件[22]。麥角固醇含量在維持細(xì)胞完整性和穩(wěn)定性起著重要的作用[23]。所以，麥角固醇產(chǎn)量與細(xì)胞生長有關(guān)。

2.5 最適磁場條件對紫色紅曲菌麥角固醇代謝過程的影響

在發(fā)酵的0～2 d用1.2 mT的低頻磁場處理的條件下，紫色紅曲菌在處理和未處理時(shí)的發(fā)酵代謝麥角固醇的動力學(xué)如圖4所示。處理組與對照組麥角固醇產(chǎn)量的動力學(xué)呈現(xiàn)的趨勢是一致的，但處理組在磁場處理后的曲線斜率明顯增大，磁場處理使得麥角固醇的增長率由0.43 mg/（g·d）增加到0.74 mg/（g·d），麥角固醇的增長率提高了73.1%，產(chǎn)量在發(fā)酵第12天達(dá)到了7.08 mg/g，比對照組增加了62.5%。結(jié)果表明，紫色紅曲菌經(jīng)磁場在發(fā)酵的0～2 d處理后，麥角固醇產(chǎn)量的增長率明顯高于對照組，而磁場沒有必要在整個(gè)發(fā)酵期間全程處理。類似的結(jié)果在乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸鏈球菌肽[13]、啤酒酵母產(chǎn)乙醇的量[14]和黏紅酵母產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶[15]也有報(bào)道。

圖 4 紫色紅曲菌產(chǎn)麥角固醇的發(fā)酵動力學(xué)Fig. 4 Fermentation kinetics for ergosterol production by Monascus purpurcus

上述研究結(jié)果表明，低頻磁場可以作為提高紫色紅曲菌提高麥角固醇產(chǎn)量的一種有效方法。這種方法可以達(dá)到或高于其他方法的效果，如突變菌種法[10]、優(yōu)化培養(yǎng)基法[11]和優(yōu)化發(fā)酵條件法[12]等。這些研究結(jié)果表明，人們可通過調(diào)整低頻磁場的處理?xiàng)l件，來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)微生物合成有益產(chǎn)物而抑制有害產(chǎn)物，這也正是低頻磁場輔助發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢所在。

2.6 最適磁場處理?xiàng)l件下紫色紅曲菌生物量在整個(gè)發(fā)酵周期的變化

在整個(gè)發(fā)酵周期中，每隔2 d對紫色紅曲菌的發(fā)酵液進(jìn)行取樣，用菌絲干重法測定發(fā)酵液中的生物量，處理組為在紫色紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)的0～2 d用1.2 mT的低頻磁場處理然后培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)，由圖5可知，處理組與對照組在發(fā)酵周期的生物量變化趨勢相同，都表現(xiàn)為先緩慢增長，接著快速增長，最后趨于緩慢降低。但處理組在磁場處理后的曲線斜率明顯增大，磁場處理使得生物量增長率由0.246 g/（g·d）增加到0.333 g/（g·d），生物量的增長率提高了35.53%，生物量在發(fā)酵第12天達(dá)到了3.2 g/L，比對照組增加了31.68%。結(jié)果表明，在此磁場處理?xiàng)l件下，磁場促進(jìn)了麥角固醇的代謝，并促進(jìn)了紅曲菌的生長。

圖 5 磁場處理前后生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig. 5 Biomass of Monascus purpureus during and after magnetic field exposure

麥角固醇作為真菌生物量指示劑，是細(xì)胞膜上的一種固醇類化合物，專一性很強(qiáng)，可以通過測定麥角固醇的含量來推測真菌生物量，因此不難看出，生物量和麥角固醇存在一定正比關(guān)系[24-25]。以上研究結(jié)果再次論證了此觀點(diǎn)。

2.7 最佳磁場處理?xiàng)l件對紫色紅曲菌其他主要代謝產(chǎn)物的影響

以不經(jīng)磁場處理為對照組，將紫色紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)的0～2 d用1.2 mT的低頻磁場處理，然后培養(yǎng)至發(fā)酵11 d，測得發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸、洛伐他汀和橘霉素的產(chǎn)量，由圖6可知，最佳磁場條件下洛伐他汀和橘霉素產(chǎn)量與對照組相比沒有 明顯差異，而γ-氨基丁酸產(chǎn)量提高了37.7%，該結(jié)果表明，最適磁場條件下沒有促進(jìn)紅曲菌有害代謝產(chǎn)物橘霉素的產(chǎn)生，反而促進(jìn)了有益產(chǎn)物γ-氨基丁酸的產(chǎn)生。在磁場條件下，促進(jìn)麥角固醇及γ-氨基丁酸等有益產(chǎn)物的產(chǎn)生且對有害代謝物橘霉素沒有造成影響，可能是磁場干擾了代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶的活性才會出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。

圖 6 最適磁場處理?xiàng)l件下γ-氨基丁酸、洛伐他汀和橘霉素產(chǎn)量Fig. 6 Yields of GABA, lovastation and citrinin under optimal magnetic field treatment conditions

3 結(jié) 論

紫色紅曲菌在發(fā)酵培養(yǎng)的0～2 d經(jīng)1.2 mT的低頻磁場處理后，麥角固醇和生物量的增長率分別提高了73.1%和35.53%。發(fā)酵第12天時(shí)，麥角固醇產(chǎn)量達(dá)到了7.08 mg/g，生物量達(dá)到3.2 g/L，比對照組分別增加了62.5%和31.68%。在最適磁場條件下，沒有促進(jìn)紅曲菌有害代謝產(chǎn)物橘霉素的產(chǎn)生，反而促進(jìn)了有益產(chǎn)物γ-氨基丁酸的產(chǎn)生。

微生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，微觀上受基因調(diào)控[26]，宏觀上受到環(huán)境因素如培養(yǎng)基條件、溫度、光照等影響[17]。由對照組和實(shí)驗(yàn)組結(jié)果可看出，紫紅曲菌受到磁場影響是磁場強(qiáng)度、作用時(shí)間和作用時(shí)期三者綜合作用的結(jié)果，一方面體現(xiàn)了磁場生物效應(yīng)的多態(tài)性、多因素和聯(lián)合作用，另一方面也與紅曲菌本身生物學(xué)特性有關(guān)。關(guān)于磁場對紅曲菌產(chǎn)麥角固醇的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Low-Frequency Magnetic Field on Ergosterol Production by Monascus purpureus in Liquid-State Fermentation

WAN Yunlei1, HAN Hongxia1, LI Li1, WU Xiaojie1, GAO Mengxiang1,2,*
(1. College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. Jingchu Food Research and Development Center, Yangtze University, Jingzhou 434025, China)

We explored the effects of low-frequency magneticeld (LF-MF) on the production of ergosterol by fermentation with Monascus purpurcus and further determined the optimal LF-MF treatment conditions such as LF-MF intensity, time treatment time and the fermentation stage when M. purpurcus was treated with LF-MF on ergosterol production by liquid-state fermentation of M. purpurcus. We also investigated the effects of LF-MF on the metabolism of ergosterol by M. purpurcus, and examined the change in M. purpurcus biomass throughout the fermentation period and the effects on other main metabolites of M. purpurcus under optimal treatment conditions. Results showed that ergosterol yield was 7.08 mg/g and the biomass of M. purpurcus was 3.2 g/L on the 12thday of fermentation, which were respectively increased by 62.5% and 31.68% as compared to that of the control when M. purpurcus was treated by LF-MF at an intensity of 1.2 mT during therst two days of fermentation. Consequently, LF-MF was an effective method to enhance ergosterol yield. This result may provide evidence supporting the use of LF-MF to improve the production of bene cial microbial metabolites by fermentation.

low-frequency magneticeld (LF-MF); Monascus purpurcus; biomass; ergosterol; liquid-state fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201710007

Q937；TS201

A

1002-6630（2017）10-0037-05

萬云雷, 韓紅霞, 李利, 等. 低頻磁場對紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 37-41.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710007. http://www.spkx.net.cn

WAN Yunlei, HAN Hongxia, LI Li, et al. Effect of low-frequency magnetic field on ergosterol production by Monascus purpureus in liquid-state fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(10): 37-41. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710007. http://www.spkx.net.cn

2016-07-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371829）

萬云雷（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品的微生物利用。E-mail：ylwan1992@sina.com

*通信作者：高夢祥（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵和農(nóng)副產(chǎn)品深加工。E-mail：mxgao0398@163.com