李金春，李家鵬，周 彤，喬曉玲，許隨根，戚 彪，米瑞芳，曲 超，許 典

引物3’端不同堿基錯配情況下實時熒光定量PCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律

李金春，李家鵬*，周 彤，喬曉玲*，許隨根，戚 彪，米瑞芳，曲 超，許 典

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

以錯配反應與正常反應之間的ΔCt值為指示，研究不同堿基錯配類型、位置與個數條件下引物3′端與模板之間非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，并構建ΔCt值的二次多項式回歸模型。結果表明，堿基錯配種類、位置、個數對實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）的非特異性擴增都有顯著影響，并呈現(xiàn)出較強的規(guī)律性。堿基類型上，研究的各個位置上異型錯配較易發(fā)生非特異性擴增，而同型錯配則較難發(fā)生，并且兩種錯配類型之間有顯著性差異（P＜0.05）；錯配位置上，相同條件下引物3’端第1位堿基錯配對ΔCt值影響最大，錯配位置遠離3’端時對ΔCt值的影響逐漸減小，非特異性擴增也更容易發(fā)生；錯配個數上，隨著錯配堿基個數的增加對ΔCt值得影響程度不斷增大，非特異性擴增較難發(fā)生。構建ΔCt值預測模型R2達到0.837 1，根據此模型可以預測出不同位置、不同錯配類型條件下ΔCt值，從而可以判斷RT-qPCR非特異性擴增的發(fā)生的難易程度。

肉類摻假；循環(huán)閾值；堿基錯配；非特異性擴增；引物特異性

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術具有準確度高、穩(wěn)定性好、高效便捷等優(yōu)點，已廣泛應用于食品真?zhèn)闻c摻假鑒別[1-4]、食品轉基因成分檢測[5-6]、食品致病菌檢測[7-9]等多個檢測項目中，已成為肉類品種鑒別的主流方法[10-11]，在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮著重要作用。引物特異性是RT-qPCR方法體系中關鍵性能指標之一，特別是對用于食品真?zhèn)螜z測的RT-qPCR方法來說更是核心指標[12-13]。設計和選取的引物體系對擴增目標DNA序列需要具有唯一性[14]，即在具有多種相近序列的復雜DNA模板中，引物體系只擴增出目標模板，而不擴增其他的相似序列DNA模板。但當存在相似DNA序列的復雜樣本時，引物和模板之間容易發(fā)生非特異性擴增，導致出現(xiàn)假陽性結果，對檢測結果判定帶來干擾[15]。

國內外對引物與模板之間非特異性擴增的研究相對較少。Wu等[16]將引物中每個堿基分別替換成其余3 種堿基后得到一系列新引物，新引物再與模板進行非特異性擴增，發(fā)現(xiàn)堿基錯配位置對PCR反應擴增效率有較大影響，并提出一種評價引物擴增能力的方法；Brett等[17]研究了引物中間位置和靠近引物5’端的單個或多個堿基與模板發(fā)生非特異性擴增對RT-qPCR擴增準確性的影響，發(fā)現(xiàn)中間位置和引物5’端的堿基錯配也能較大程度的降低RT-qPCR定量準確性。Sü?等[18]發(fā)現(xiàn)在RT-qPCR引物和探針中的單堿基錯配都能夠引起較大的定量誤差，誤差甚至高到63.12%。Klungthong等[10]發(fā)現(xiàn)引物3’端單一堿基錯配便可較大程度的降低方法靈敏度。目前，尚缺少系統(tǒng)考察3個因素：堿基錯配類型、位置、個數對RT-qPCR非特異性擴增發(fā)生規(guī)律影響的報道，而現(xiàn)有報道也多集中于對其中某一因素的研究，以及堿基錯配對擴增效率、定量準確性和方法靈敏度等方面的研究，因此研究影響非特異性擴增反應發(fā)生的關鍵因素及其作用規(guī)律就顯得尤為迫切。

為探究引物和模板之間非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，篩選本實驗室屬性相近、序列各異的引物作為研究基礎。由于引物3’端核苷酸序列對RT-qPCR特異性擴增起到至關重要的作用，因此選取引物3’端核苷酸序列作為研究對象，在正常引物的基礎上人為設計一系列錯配引物，研究引物中錯配堿基種類、個數、位置對RT-qPCR非特異性擴增發(fā)生規(guī)律的影響，并通過錯配反應與正常反應之間的Ct值之差（ΔCt值）的預測模型來判斷非特異性擴增的發(fā)生的難易程度。研究錯配引物與目標物種模板之間RT-qPCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，對于建立引物評價體系和設計技術都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬四號肉 北京資源公司；牛肉 北京御香苑畜牧有限公司；Qiagen69504血液、組織DNA提取試劑盒德國Qiagen公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；D2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；TaKaRa 2×酶體系預混液 大連寶生物工程（大連）有限公司；SYBR GreenⅠMaster 德國Roche公司；RT-qPCR 96 孔板羅氏診斷產品（上海）有限公司。實驗中涉及引物均由實驗室自行設計，并由英濰捷 基（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Prep多樣品勻漿儀 美國Omni公司；BT224S分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LightCycler 480熒光PCR儀 羅氏診斷產品（上海）有限公司；PCR儀、Biorad GelDoc XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；S-100渦旋振蕩器 大洋科學工業(yè)株式會社；Eppendorf 5417型離心機 艾本德中國有限公司；Synergy H4全功能酶標儀 美國BioTek公司；DYCP-31F瓊脂糖水平電泳儀 北京六一儀器廠；GI54DW全自動高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法

將肉和水按照1∶4（m/m）的比例進行準確稱量并進行勻漿，13 500 r/min勻漿10 min。吸取100 μL勻漿液于1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明書操作提取基因組DNA，總DNA溶解于100 μL TE緩沖液中，通過酶標儀測定280 nm和260 nm波長處的吸光度，計算DNA純度和質量濃度。然后用TE緩沖液稀釋至5 ng/μL，作為普通PCR反應模板。

1.3.2 RT-qPCR模板制備方法

模板通過普通PCR反應進行擴增，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，然后用凝膠試劑盒回收得到。普通PCR反應為25 μL體系，其中TaKaRa 2×酶體系預混液12.5 μL；濃度為5 μmol/L的上、下游引物各1.5 μL，引物序列如表1所示；質量濃度為5 ng/μL全基因組模板溶液2.0 μL；滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。普通PCR循環(huán)條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共計35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表 1 正常反應中的引物序列Table 1 Pr imers used for normal RT-qPCR

擴增結束后按照凝膠回收試劑盒操作流程對PCR產物進行回收，然后通過酶標儀測定回收得到的目的片段質量濃度，用TE緩沖液稀釋至2×10－3ng/μL，作為RT-qPCR的模板。

1.3.3 錯配反應引物設計與合成

表 2 單堿基錯配實驗方案Table 2 Experimental program of single base-pair mismatches in RT-qPCR

圖 1 RT-qPCR反應過程中的非特異性擴增Fig. 1 Schematic diagram of base pair mismatch in RT-qPCR

以引物CMRC-2-1F為例描述PCR反應非特異性擴增過程，具體如圖1所示。篩選本實驗室屬性相近、序列各異的引物作為基礎（表1），按照表2和表3方案合成系列錯配引物。其中表2是單堿基錯配方案，涵蓋了3 個位置不同堿基配對的所有36 種情況。表3列出了2 個和3 個堿基典型錯配方案，包含典型錯配類型。

表 3 雙堿基、三堿基錯配實驗方案Table 3 Experimental program of double base-pair and triple basepair mismatches in RT-qPCR

1.3.4 RT-qPCR反應體系

用1.3.3節(jié)中合成的引物與其對照引物，及對應模板組成RT-qPCR反應擴增體系，分別記錄錯配引物及其正常引物的Ct值，并計算其Ct值之差，作為衡量非特異性擴增反應發(fā)生難易程度的衡量標準。ΔCt值越大代表非特異性擴增越難發(fā)生，反之則容易發(fā)生。

RT-qPCR擴增體系為10 μL體系，其中Roche 2×酶體系預混液5 μL；濃度為5 μmol/L的上、下游引物各0.6 μL；質量濃度為2×10－3ng/μL模板溶液2.0 μL；滅菌雙蒸水補足體積至10 μL。RT-qPCR循環(huán)條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，退火和延伸合并為一步，溫度為60 ℃，時間為45 s，共計40 個循環(huán)。

1.3.5 ΔCt值預測模型構建

由單堿基錯配結果可將堿基錯配對ΔCt值得影響程度由小到大分為5 個等級，然后給所有單堿基、雙堿基和三堿基錯配情況（共計56 種情況）的不同位置按照錯配等級賦予分值，而不同的錯配情況又對應不同的ΔCt值，則可以得到引物3’端3 個位置與ΔCt值之間的數量對應關系。然后通過二次多項式逐步回歸的方法便可得到ΔCt值與引物3’端3 個位置上不同錯配類型之間的數學預測模型，模型公式見式（1）[20]：

式中：x、y、z分別表示引物3’端第3位、第2位、第1位；pi（i=1,2,310）為多項式回歸系數。

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

用DPS 7.05軟件（中國，唐啟義）對ΔCt預測模型進行數據處理和模型的構建；用PASWStatistics 18.0軟件（美國SPSS公司）進行位置以及個數對ΔCt影響的顯著性分析；t檢驗和R2以及數據處理通過Microsoft Excel 2007軟件（美國微軟公司）進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 堿基錯配類型對非特異性擴增的影響

結果顯示，堿基錯配種類對非特異性擴增出現(xiàn)的難易程度有顯著影響?；旧?，引物與模板對應位置上出現(xiàn)同類型堿基錯配（嘌呤/嘌呤，或嘧啶/嘧啶）會對非特異性擴增產生明顯的抑制作用，而異型堿基錯配（嘌呤/嘧啶，或嘧啶/嘌呤）對抑制非特性擴增的作用不大。由表4可知，當將引物M-1-T1 3’端第1位T被替換成A（A/A）和G時（G/A），ΔCt分別達到了17.70和14.12，而替換成C時，ΔCt僅為3.63，前者發(fā)生非特異性擴增的概率不足后者的千分之一。t檢驗結果顯示，3’端第1位同型錯配和異型錯配之間對ΔCt值影響有極顯著差異（P＜0.01），無論是第2位還是第3位兩種錯配類型之間對ΔCt值的影響有顯著差異（P＜0.05），且該影響程度差距逐步縮小。這可能與4種核苷酸的分子結構有關，同類核苷酸之間的錯配DNA合成酶的容錯率更低一些。實驗結果證實了異型錯配發(fā)生的難易程度明顯低于同型錯配，而異型錯配之所以容易發(fā)生，可能是由于核苷酸的5-甲基胞嘧啶脫氨基反應相對比較容易發(fā)生導致的[21-22]，這與生物遺傳中突變類型多為轉換結果一致[23]。另外由表4可知，錯配反應中有堿基A參與的，一般ΔCt值都會偏大，說明堿基種類A對非特異性擴增產生明顯的抑制作用。

表 4 單堿基錯配RT-qPCR反應中ΔCt值Table 4 Δ Ct values of single base-pair mismatches in RT-qPCR

2.2 堿基錯配位置對非特異性擴增的影響

表 5 雙堿基、三堿基錯配RT-qPCR中ΔCt值Table 5 ΔCt values of double and triple base-pair mismatches in RT-qPCR

堿基錯配位置對非特異性擴增發(fā)生的難易程度有顯著影響，且越是遠離3’端錯配位置對ΔCt值的影響呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。由表4可知，單堿基錯配反應自3’端起3 個位置ΔCt的平均值依次為8.04、3.22、1.06，最大值依次為17.70、8.99、4.82，均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。這說明越是遠離3′端錯配位置對ΔCt值的影響呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，此時RT-qPCR非特異性擴增越是容易發(fā)生，這與Ayyadevara等[24]研究的結果相一致。而由t檢驗可知，錯配類型為異型錯配時，3’端第1位和第2位之間對ΔCt值影響不顯著（P=0.11），但兩者與第3位相比均具有顯著性差異（P＜0.05）；當為同型錯配時，3’端3 個位置間對ΔCt值影響具有極顯著的差異（P＜0.01），說明堿基錯配位置對非特異性擴增發(fā)生的難易程度有顯著影響。而由表5可知，雙堿基錯配中第1、2位堿基錯配最大ΔCt值為22.48，第1、3位的為20.36，而第2、3位的為18.85，同樣說明堿基錯配位置越靠近3’端對ΔCt值的影響越大，非特異性擴增越難以發(fā)生，這與單堿基錯配結果相一致。而由t檢驗結果可知，三者之間并無顯著差異，說明當堿基錯配個數增加后錯配位置對Δ Ct值影響減弱。

2.3 堿基錯配個數的影響

由表4、5可知，堿基錯配個數對ΔCt值得影響同樣明顯。引物3’端3 個堿基發(fā)生的錯配反應中，單堿基、雙堿基以及三堿基錯配ΔCt值的平均值依次為4.10、13.66、17.15，ΔCt值的最大值依次為17.70、22.48、22.94，兩者均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，說明隨著錯配堿基個數的不斷增加，對ΔCt值的影響程度不斷增大，對非特異性擴增的抑制也不斷增強。而由t檢驗結果顯示，錯配類型為異型錯配時，單個、雙個以及3 個堿基錯配時對ΔCt值的影響存在極顯著差異（P＜0.01）；而當錯配類型為同型錯配時，單堿基錯配分別與雙堿基錯配和三堿基錯配之間存在顯著性差異（P＜0.05），但雙堿基錯配與三堿基錯配之間對ΔCt值的影響并無顯著差異（P=0.16），說明錯配堿基個數增加到一定程度后對ΔCt值的影響程度便會減弱。

2.4 因素交互作用研究與Δ Ct值預測模型構建

為研究因素之間的交互作用和數量相關關系，用三元二次多項式對上述結果進行回歸分析。由單堿基錯配結果可知，同型錯配的ΔCt值明顯高于異型錯配的，并且相同錯配類型條件下含有堿基A的ΔCt值也相對偏大，據此將堿基錯配對ΔCt值得影響程度由小到大分為5 個等級，分別為“未發(fā)生錯配”、“異型錯配”、“異型錯配（含堿基A）”、“同型錯配”以及“同型錯配（含堿基A）”。并且給每個等級依次賦值“0、1、2、3、4”。將所有單堿基、雙堿基和三堿基錯配情況（共計56種情況）的不同位置按照錯配等級進行賦分，而不同的錯配情況又對應不同的ΔCt值，則可以得到引物3’端3 個位置與Δ Ct值之間的數量對應關系，如表6所示。

通過二次多項式逐步回歸的方法對表6中數據進行擬合，得到3 個位置上不同錯配類型與ΔCt的預測模型，模型公式見式（2）：

ΔCt=－8.49+5.41x+8.32y+8.62z－0.52x2－1.26y2－0.76z2－0.21xy－0.40xz－0.62yz （2）

通過公式（2）可知，引物3’端3 個位置上不同錯配類型對ΔCt值都有較大的影響，而從公式中二次項xy、yz以及xz可知，3 個位置中的任意兩個之間都存在明顯的交互作用。對表6的實驗結果進行統(tǒng)計分析，得到的方差結果如表7所示，模型F值為25.70，P＜0.000 1，模型是極顯著的，模型 擬合成功?；貧w模型R2達到0.837 1，根據此模型在一定程度上可以預測出不同位置、不同錯配類型條件下ΔCt值。

表 6 ΔCt值與3’端3 個位置上不同錯配類型之間的數量關系Table 6 Relationship between ΔCt value and mismatch types

表 7 Δ Ct值回歸模型方差分析結果Table 7 Analysis of variance for regression model for ΔCt

將文獻[25]報道的單堿基錯配ΔCt值與通過模型得到的預測值進行比較驗證，結果如表8所示，可以看出模型殘差值的絕對值均小于1，上下浮動于零左右，說明該模型預測的ΔCt值是可信的。因此，應用二次多項式回歸模型能夠預測出引物3’端不同位置、不同錯配類型條件下Δ Ct值，從而可以判斷RT-qPCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律。

表 8 ΔCt值回歸模型的殘差值Table 8 Residuals of regression model for ΔCt

3 討 論

肉類摻假售假事件近年來頻頻發(fā)生，2013年更是爆發(fā)了歐洲“馬肉風波”事件[26-27]，引起了全球關注，基于RT-qPCR的動物源性成分檢測技術也隨之成為研究熱點[28-30]。由于物種之間DNA序列相近，極易產生非特異性擴增，導致假陽性結果出現(xiàn)，因此該檢測技術對引物特異性要求較高，為引物設計和篩選帶來了較大難度，并且引物設計完成后通常需要做特異性評價實驗，該評價不但費時費力，而且需要收集盡可能多的物種肌肉或血液等生物樣本，極大增加了方法開發(fā)成本。

本實驗通過引物3’端一個或者多個堿基與模板發(fā)生錯配反應引起Ct值變化來評價RT-qPCR中非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，發(fā)現(xiàn)引物上某些堿基發(fā)生錯配對ΔCt值影響較小，甚至毫無影響，說明引物堿基發(fā)生置換后仍能與模板發(fā)生非特異性擴增，間接說明用于設計引物的該段模板特異性較差。引物3’端不同種類、位置、個數堿基錯配對RT-qPCR非特異性擴增發(fā)生規(guī)律的影響截然不同，本實驗構建了3’端3 個位置上不同堿基錯配類型與ΔCt之間預測模型，根據此模型在一定程度上可以預測出不同位置、不同錯配類型條件下ΔCt值，提出了一種評價RT-qPCR非特異性擴增發(fā)生難以程度的方法，從而可以描述非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律。設計引物時，掌握引物3’端堿基錯配對RT-qPCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，避免選擇DNA序列中易于發(fā)生非特異性擴增的堿基位置、堿基種類，確保用于設計引物的特異序列具有真實的特異性，對于提高特異性引物設計效率，降低基于RT-qPCR的動物源性成分檢測方法的開發(fā)成本具有重要的實用性價值。

除引物3’端核苷酸序列外，DNA聚合酶保真性、探針序列、試劑體系、擴增條件等因素都會對非特異性擴增的產生有影響，因此將會進行持續(xù)系統(tǒng)的研究，建立完整的評價體系，為該領域的引物設計提供參考。根據堿基錯配反應ΔCt值評價RT-qPCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律，可用于指導特異性引物的設計，為肉制品真?zhèn)舞b別方法的建立提供技術支持，有利于維護肉制品安全，保障消費者、肉制品加工企業(yè)的合法權益。

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Pattern of Occurrence of Nonspecific Amplification in Real-Time Fluorescent PCR with Different Base Pair Mismatches at the Primer 3’ End

LI Jinchun, LI Jiapeng*, ZHOU Tong, QIAO Xiaoling*, XU Suigen, QI Biao, MI Ruifang, QU Chao, XU Dian
(Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

Primer specificity is one of the key figures of merit for the identification of meat adulteration by polymerase chain reaction (PCR). In this study, the pattern of occurrence of non-specific amplification in real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was evaluated in terms of the Δ Ct value between base pair matches and mismatches. Three independent variables including the type, position and number of base pair mismatches were investigated for building a quadratic polynomia l to predict the Δ Ct value. Results showed that the type, location, and number of base pair mismatches had a significant impact on non-specific RT-qPCR amplification in a very regular pattern. As far as different types of base pair mismatches were concerned, nonspecific amplification between purine and pyrimidine, but not between different purines or between different pyrimidines, occurred easily, with a significant difference being observed between two types of base pair mismatches. For base position, the first base of the 3’ end of the primer had the greatest impact on the Δ Ct value; the mismatch position gradually far away from the 3’ end had a decreased effect on the Ct value, making nonspecific amplification occur more easily. The greater the number of base pair mismatches was, the more significant the influence on the Δ Ct value was, leading to reduced occurrence of nonspecific amplification. The prediction model for Δ Ct was fitted using a stepwise method with correlation coefficient of more than 0.80, which could provide a useful and accurate method to predict the ΔCt value within certain limits.

meat adulteration; cycle threshold value; base pair mismatch; nonspecific amplification; primer specificity

10.7506/spkx1002-6630-201710045

TS207.3

A

1002-6630（2017）10-0277-07

2016-11-01

國家自然科學基金面上項目（31271877）；“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD0401203）

李金春（1987—），男，工程師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：lijinchun1987@163.com

*通信作者：李家鵬（1979—），男，高級工程師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：ljp7915@126.com

喬曉玲（1964—），女，教授級高級工程師，本科，研究方向為肉品科學和加工技術。E-mail：cmrcsen@126.com

李金春, 李家鵬, 周彤, 等. 引物3’端不同堿基錯配情況下實時熒光定量PCR非特異性擴增的發(fā)生規(guī)律[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 277-283. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710045. http://www.spkx.net.cn

LI Jinchun, LI Jiapeng, ZHOU Tong, et al. Pattern of occurrence of nonspecific amplification in real-time fluorescent PCR with different base pair mismatches at the primer 3’ end[J]. Food Science, 2017, 38(10): 277-283. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710045. http://www.spkx.net.c n