黃有強(qiáng)

華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司 浙江 杭州 310011

微波輔助提取三葉青多糖工藝優(yōu)化及其拮抗炎癥細(xì)胞的研究

黃有強(qiáng)

華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司 浙江 杭州 310011

三葉青多糖 微波 炎癥細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)研究

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤的塊根或全草，具有清熱解毒、活血祛風(fēng)等功效。近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗腫瘤、抗病毒、退高熱等特有的作用，受到國內(nèi)外研究人員高度的關(guān)注[1-3]。多糖是三葉青中的重要組成成分[4]，目前對三葉青多糖的研究表明，其具有抗腫瘤，抗肝損傷，調(diào)節(jié)免疫的功效[5]，然而尚未見到三葉青多糖抗炎機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道。本文將采用微博輔助法提取三葉青多糖，并對其提取條件進(jìn)行考察和優(yōu)化，得到三葉青多糖最佳制備工藝。采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型，探究三葉青多糖拮抗炎癥細(xì)胞的作用并初步闡明其作用機(jī)制。

1 材料與儀器

電子天平AE240（瑞士METTLER），微波爐（EM-925FDN-SS，美的集團(tuán)），HH-S數(shù)控恒水浴鍋（金華市文華科教實(shí)驗(yàn)儀器廠），YAMATO低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)一體機(jī)（日本YAMATO公司），SHIMADZU UV-2450紫外分光光度儀（日本島津公司），VD115真空干燥器（德國賓得）；550型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；311型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，USA）。三葉青藥材，產(chǎn)地為浙江，由杭州華東中藥飲片有限公司提供，批號:160121。無水葡萄糖對照品（KAYON公司，批號:20151203）。細(xì)胞株:小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供)，加入10%的胎牛血清、100U/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中生長。細(xì)胞生長至70%～80%融合后進(jìn)行傳代，2～3天傳代1次。LPS(Sigma公司，批號:L2880)，鼠 TNF-α、IL-6 ELIS A檢測試劑盒(美國R&D公司產(chǎn)品)；胎牛血清(美國GIBCO公司產(chǎn)品)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 三葉青多糖提取工藝考察:三葉青粉末10g，加15倍蒸餾水，置于微波爐內(nèi)加熱提取后，加無水乙醇，使醇沉濃度達(dá)80%，醇沉過夜，獲得三葉青多糖，棄去上清液，離心，沉淀真空干燥，稱重，計(jì)算多糖得率及多糖含量。以多糖含量為考察指標(biāo)，以溶劑量、提取功率、提取時(shí)間為考察因素，各設(shè)三個水平，作L9(34)正交試驗(yàn)，見表1。通過正交試驗(yàn)表統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取工藝。

表1 因素水平表

2.2 多糖含量測定：分述如下。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水制成0.25mg/ml的對照品溶液。精密吸取梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml，分別定容至3ml，得系列對照品溶液，各取1ml加入1ml5%苯酚（臨用前現(xiàn)配制）及5ml濃硫酸，100℃水浴30min，取出，放入冰水浴中冷卻15min，以相應(yīng)的試劑為空白，在490nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 換算因素:精確稱取干燥的三葉青多糖10mg，置于100ml量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。分別精取多糖溶液0.1ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法操作，測定吸收度。另取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25ml，同法操作，求出多糖溶液中的葡萄糖含量，按下式計(jì)算換算因素:F=W/C×D，式中:W為多糖的質(zhì)量，C為多糖溶液中的葡萄糖濃度，D為稀釋倍數(shù)。

2.2.3 樣品測定:精密量多糖溶液1ml，置100ml容量瓶中，蒸餾水定容，制成供試品溶液，取1ml至10ml具塞試管中，照1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自精密加入5%苯酚溶液起，依法測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，按下式計(jì)算樣品中多糖的含量:多糖含量（%）＝Cs×D×F×V/W，式中:Cs為供試品溶液中葡萄糖濃度，D為供試品溶液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因素，V為供試溶液體積，W為供試品質(zhì)量。

2.3 三葉青多糖拮抗脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型作用:三葉青多糖、LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞用10%的小牛血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×106個/ml，分為對照組、模型組、三葉青多糖組。對照組加雙純水(2μg/ml)；模型組加入LPS(2μg/ml)，三葉青多糖組加入LPS (2μg/ml)培養(yǎng)30min后，分別加入濃度100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml的三葉青多糖，陽性對照采用地塞米松（5μg/ml）。各組均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞的上清液，按照試劑盒的說明，檢測標(biāo)本中腫瘤壞死因子（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳提取工藝優(yōu)化:采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為因素，以多糖含量為考察指標(biāo)。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，最佳提取工藝為:A2B3C3，故最終確定三葉青多糖的提取工藝:加20倍水，500W微波功率下，提取10min。

表2 三葉青多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線:以葡萄糖對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得回歸方程:y=8.579x+ 0.007，r=0.9995。結(jié)果 表 明多 糖 在 0.09mg/ml～0.125mg/ml之間有良好的線性關(guān)系。換算因素:根據(jù)計(jì)算公式F=W/C×D，式中:W為多糖的質(zhì)量，C為多糖溶液中的葡萄糖濃度，D為稀釋倍數(shù)。測得F=1.701。

3.3 三葉青多糖抑制細(xì)胞死亡及對TNF-α、IL-6的影響：分述如下。

3.3.1 三葉青多糖對RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響:培養(yǎng)24h后，模型組RAW 264.7巨噬細(xì)胞只有很少的細(xì)胞染成紅色，形狀多為圓形，說明RAW 264.7巨噬細(xì)胞生長少，且大量死亡，表明LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞衰老死亡。三葉青多糖組，隨著三葉青多糖濃度的增加，RAW 264.7巨噬細(xì)胞被染成紅色且貼壁生長，形狀呈不規(guī)則菱形的巨噬細(xì)胞數(shù)量越來越多，說明三葉青多糖可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并促進(jìn)細(xì)胞生長。

3.3.2 三葉青多糖對LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞TNF-α以及IL-6的影響:模型組巨噬細(xì)胞經(jīng)過LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α以及IL-6含量明顯高于空白組(P＜0.01)，三葉青多糖組中，隨著濃度增加，對LPS致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及IL-6的抑制更加明顯。見表3。

表3 各組巨噬細(xì)胞TNF-α以及IL-6的含量（±s，ng/L）

表3 各組巨噬細(xì)胞TNF-α以及IL-6的含量（±s，ng/L）

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別空白組模型組地塞米松組（5μg/mL）三葉青多糖組（100μg/mL）三葉青多糖組（50μg/mL）三葉青多糖組（25μg/mL）TNF-α 30.28± 8.32*302.36±30.32 152.54±26.66*IL-6 21.00± 6.33*408.69±18.52 182.98±15.09*189.30±21.00*185.67±10.65*241.74±25.33*195.36±11.44*265.58±30.45*222.98±15.32*

4 討論

三葉青多糖是三葉青中含量較高的活性成分，傳統(tǒng)的多糖提取工藝均采用煎煮方法，會導(dǎo)致多糖部分水解，而微波輔助法提取多糖可以縮短實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)時(shí)間，同時(shí)還可以提高提取率及產(chǎn)品純度并且節(jié)省溶劑[6]。本實(shí)驗(yàn)通微波法對三葉青多糖進(jìn)行提取，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取工藝，得到多糖的率為14.36%，與傳統(tǒng)方法相比縮短提取時(shí)間，提高提取效率。

三葉青具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等作用。本研究表明，三葉青多糖對于脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡有明顯的抑制作用，且巨噬細(xì)胞中的炎性因子TNF-α、IL-6的含量較模型組明顯降低，呈現(xiàn)一定的量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三葉青多糖最佳給藥劑量為20μg/ml～100μg/ml，同時(shí)為三葉青多糖用于脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞衰老死亡提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2016-09-21