胡雙燕 熊榮兵 傅曉駿#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 金華 321017

腎毒寧顆粒劑對(duì)慢性腎衰竭大鼠抗氧化作用研究

胡雙燕1熊榮兵2傅曉駿2#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 金華 321017

目的：研究腎毒寧顆粒劑抗氧化應(yīng)激的作用及延緩慢性腎功能衰竭進(jìn)展的可能作用機(jī)制。方法：Platt法5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型，術(shù)后一周下頜靜脈采血，測(cè)定腎功能，根據(jù)肌酐分組，分為腎毒寧顆粒低、中、高劑量組，科素亞組，另設(shè)正常組，模型組，每組18只，灌胃60天，在處死大鼠前1天收集24h尿液，測(cè)定24h尿蛋白定量,處死大鼠測(cè)定尿素氮（Bloodureanitrogen，BUN）、血肌酐（serumcreatinine，Scr）、24h尿蛋白含量、超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）。結(jié)果：與模型組比較，各治療組BUN、Scr、24h尿蛋白含量表達(dá)均下降，SOD升高，MDA表達(dá)均下降(P＜0.05)，腎毒寧顆粒低，中，高劑量組與科素亞組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：腎毒寧顆粒劑可降低大鼠BUN、Scr、24h尿蛋白含量，保護(hù)腎功能，并可以降低MDA，提高大鼠SOD含量提高抗氧化能力。

慢性腎衰竭 氧化應(yīng)激 抗氧化 腎毒寧 實(shí)驗(yàn)研究

為探討腎毒寧顆粒劑及其不同劑量具有的抗氧化應(yīng)激，延緩慢性腎功能衰竭進(jìn)展作用功效，探討腎毒寧的作用是否存在劑量相關(guān)性，我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年雄性SD大鼠(SPF級(jí))120只，8周齡,體重(200±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供。大鼠分籠飼養(yǎng)于25℃12h光照、45%濕度的環(huán)境中，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。

1.2 試驗(yàn)藥物和使用劑量:腎毒寧顆粒（廣東一方制藥有限公司，主要成分:黃芪、仙靈脾各30g，沉香粉2g，丹參、制大黃各15g，桃仁10g，黃精20g)。高劑量為人鼠計(jì)量20倍換算，低劑量5倍，中劑量為10倍?？扑貋啠ê贾菽硸|制藥有限公司生產(chǎn)）大鼠用量按照人鼠計(jì)量10倍劑量換算為=100×6/70=8.6mg/kg/d。每日每只予相應(yīng)藥液2ml灌胃。正常組和模型組給予2ml生理鹽水灌胃。

1.3 主要試劑及儀器:全自動(dòng)生化分析，尿素氮（Bloodureanitrogen，BUN）、血肌酐（serumcreatinine，scr）、24h尿蛋白含量、超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）、脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde， MDA）試劑購(gòu)自由南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型制作:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮，用碘酒、75%酒精消毒手術(shù)區(qū)后鋪巾，距左脊肋骨1.5cm處斜向外方切口,經(jīng)后腹膜取腎,暴露腎臟,分離腎周脂肪后,弧型切除2/3腎組織(主要切除皮質(zhì)部分)，用明膠海綿壓迫止血片刻,再滴加數(shù)滴纖維蛋白原和凝血酶溶液,稍等片刻,當(dāng)切面上不再有活動(dòng)性出血后復(fù)位剩余左腎,縫合；1周后再次手術(shù)切除整個(gè)右腎。另取正常SD大鼠15只,造模步驟同上,但不切除腎組織，僅剝離左右腎包膜,保留腎上腺,作為模型組。正常組正常飼養(yǎng),不做處理。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組:動(dòng)物模型造模后1周測(cè)定大鼠血肌酐，根據(jù)肌酐隨機(jī)分組。剔除手術(shù)死亡的大鼠12只，每組18只，共6組。分為A組（正常），B組（模型），C組（腎毒寧顆粒），其中腎毒寧顆粒組又分低、中、高劑量組（分別為C1、C2、C3組），D組（科素亞組）。

2.3 干預(yù)方案:Platt模型制備成功并按照血肌酐分組后，腎毒寧顆粒方組中藥每日灌胃，高劑量為人鼠計(jì)量20倍換算，低劑量為人鼠計(jì)量5倍換算，中劑量為鼠計(jì)量10倍換算。對(duì)照組科素亞每日灌胃，大鼠用量按照人鼠計(jì)量10倍劑量換算為=100×6/70=8.6mg/kg/d，共60天。灌胃容積控制在2ml以下。正常組和模型組同體積生理鹽水灌胃。

2.4 取材、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法：分述如下。

2.4.1 取材:治療結(jié)束后各組大鼠首先分別置代謝籠內(nèi)留取24h尿液,-70℃保存；末次給藥后禁食12h,摘眼球采血,分離血清后待測(cè)-70℃保存，并取腎皮質(zhì)加0.9%生理鹽水制成勻漿,取上清液備測(cè)。

2.4.2 觀察指標(biāo):血清BUN、Scr、24h尿蛋白含量、SOD、MDA。

2.4.3 檢測(cè)方法:全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血BUN、Scr水平；磺柳酸比色法檢測(cè)24h尿蛋白含量；化學(xué)比色法測(cè)定腎皮質(zhì)SOD和MDA水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料用-x±s表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 死亡情況:在實(shí)驗(yàn)過程中，共有6只大鼠死亡，其中腎毒寧低劑量組1只，中劑量組1只，高劑量組2只，科素亞組2只。

3.2 各組大鼠血清Scr、BUN及24h尿蛋白定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果情況:見表1。各組大鼠血清Scr、BUN及24h尿蛋白定量與模型組比較明顯降低(P＜0.05)，而各治療組（C1組，C2組，C3組，D組）比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；腎毒寧中,高劑量組具有相對(duì)明顯的降尿蛋白定量作用。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN及24h尿蛋白定量比較（±s）

表1 各組大鼠血清Scr、BUN及24h尿蛋白定量比較（±s）

注:與A組比較,*P＜0.05；與B組比較,▲P＜0.05。

組別 例數(shù)Scr(mmol/L)BUN(mmol/L) A組B組C1組C2組C3組D組6.86±0.63▲19.58±3.66*15.44±2.66*▲14.65±2.34*▲14.47±2.03*▲16.20±2.40*▲18 18 17 17 16 16 24尿蛋白定量(mg/24h) 41.99±12.7▲243.76±94.33*168.31±24.25*▲157.07±23.91*▲153.14±24.63*▲175.36±35.34*▲29.47± 4.40▲91.47±21.02*56.54±11.95*▲54.01±11.98*▲52.23± 9.41*▲60.70± 9.61*▲

3.3 各組大鼠血清SOD、MDA統(tǒng)計(jì)結(jié)果情況:見表2。與模型組比較，各組血清SOD明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；血清MDA明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而各治療組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；各治療組中，腎毒寧低,中劑量組提高SOD含量，降低MDA含量效果更優(yōu)。

4 討論

腎毒寧顆粒由黃芪、仙靈脾、沉香粉、丹參、制大黃、桃仁、黃精組成，方中黃芪性溫，有益氣、升陽(yáng)、補(bǔ)虛、消腫的功效，通過抗氧化、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞

代謝、利尿消腫、減少尿白蛋白排泄、促肝臟合成白蛋白、降脂、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等作用，保護(hù)腎臟細(xì)胞免受傷害,保護(hù)殘存腎單位,延緩腎臟疾病進(jìn)展的作用。仙靈脾性溫，有溫腎、助陽(yáng)、填補(bǔ)精氣作用，可以升高SOD水平，增加清除自由基能力，減少M(fèi)DA的增多，從而增強(qiáng)組織抗氧化系統(tǒng)，對(duì)抗自由基損傷，具有抗氧化、延緩衰老的作用。沉香性溫味辛，有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘作用，沉香揮發(fā)油能通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力，保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px活力，減少M(fèi)DA生成，具有一定的抗氧化作用。丹參微寒，有益氣補(bǔ)血活血之功效，丹參的脂溶性有效單體丹參酮ⅡA治療后，可使大鼠血清Bun、Cr水平降低、SOD活力明顯升高，MDA含量明顯降低。丹參酮ⅡA可以通過改善大鼠腎組織的氧化應(yīng)激，減少尿蛋白、改善腎功能和延緩腎臟損害。大黃性寒有清熱泄?jié)帷⒒钛ū阕饔?，瀉下作用增加腸道對(duì)尿毒癥毒素排泄,現(xiàn)代藥理研究證實(shí),大黃具有清除氧自由基、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、拮抗炎性細(xì)胞因子等作用。桃仁性平而活血祛瘀，能提高腎臟血流量,改善微循環(huán)和提高組織膠原酶活性,從而促進(jìn)腎內(nèi)的膠原分解、代謝,減少腎內(nèi)膠原的含量,改善腎纖維化。黃精性平而益腎補(bǔ)精，具有抗氧化、抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激水平、減輕腎組織氧化應(yīng)激損傷的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，腎毒寧顆粒劑具有一定的腎保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其改善抗氧化作用有一定的關(guān)系，其具體作用機(jī)制待進(jìn)一步研究。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

注:與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，▲P＜0.01，◆P＜0.05。

MDA(nmol/ml) 6.70±1.12▲16.71±2.11*9.11±1.30*◆8.89±0.97*◆8.67±1.76*◆9.73±1.69*◆組別A組B組C1組C2組C3組D組例數(shù)18 18 17 17 16 16 SOD(U/ml) 133.97±37.14▲76.71±15.76*113.85±19.28*◆106.96±20.17*◆116.00±19.16*◆116.23±21.06*◆

[1]郎旭軍,傅曉駿,成棟,等.腎毒寧沖劑抗慢性腎衰大鼠自由基損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2007,42（10）:602-604.

2016-09-23

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目腎毒寧對(duì)腎衰大鼠HO-1蛋白基因表達(dá)及Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，編號(hào)：LY15H270001

# 通訊作者：傅曉駿,E-mail：fuxiaojun@medmail.com.cn