姚珩，朱慧，陳野，李書紅

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

羊肚菌發(fā)酵豆渣生產(chǎn)多糖及其功能性的研究

姚珩，朱慧，陳野，李書紅*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

以豆渣為培養(yǎng)基，利用羊肚菌進(jìn)行半固體發(fā)酵，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，得到最佳的發(fā)酵條件為料液比1∶9（g/mL），接種量3.0%，發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵產(chǎn)物中多糖（CMP，Crude Morchella Polysaccharide）含量達(dá)到8.86%。同時，對CMP的功能性進(jìn)行評價，結(jié)合膽酸鹽能力試驗表明，CMP對3種膽酸鹽（無水膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、?；悄懰猁}）均有結(jié)合效果，其中對脫氧膽酸鈉的結(jié)合量最高，為（0.16±0.02）mmol/L，證明CMP有降血脂功能。體外抗氧化試驗表明，CMP在濃度為10mg/mL時對羥自由基的清除能力達(dá)98.9%，顯示其具有良好的抗氧化性。

羊肚菌；半固體發(fā)酵；多糖；功能性

豆渣是豆腐和豆奶加工過程中的副產(chǎn)品，是一種廉價的可利用資源，具有營養(yǎng)價值高，質(zhì)地疏松，來源廣泛等優(yōu)點，是微生物發(fā)酵良好的培養(yǎng)基。目前，豆渣常用作家畜飼料、肥料或直接倒掉[1]。

近年來，菌類植物作為功能性食品和醫(yī)藥材料而引得人們關(guān)注[2]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明多糖是其重要的活性物質(zhì)之一，子實體、人工培養(yǎng)的菌絲體或發(fā)酵后培養(yǎng)基中的多糖都具有潛在的抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒及提高機體免疫力等作用[3-4]。羊肚菌因營養(yǎng)價值和藥用價值而受到人們喜愛，是極為珍稀的食藥兩用真菌，但資源稀少、培育困難。而發(fā)酵是工業(yè)化、集約化生產(chǎn)的重要途徑，經(jīng)發(fā)酵、提取后獲得的多糖可作為開發(fā)功能性食品的原料[5]。

為了減少多糖生產(chǎn)的成本和豆渣造成的污染，本文以豆渣為培養(yǎng)基，利用羊肚菌進(jìn)行發(fā)酵。針對固體發(fā)酵的培養(yǎng)時間較長，而且在較致密的環(huán)境下發(fā)酵，其代謝熱的移除常造成問題，尤其是大量生產(chǎn)時，限制其大規(guī)模的產(chǎn)能，采用半固體發(fā)酵方式，運用正交試驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件，從而提高多糖產(chǎn)量。從體外抗菌活性、結(jié)合膽酸鹽能力和體外抗氧化性3個方面，對提取的多糖（CMP）進(jìn)行功能性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

豆渣：天津市山海關(guān)豆制品有限公司；羊肚菌（ACCC 50764）：中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌、沙門氏菌：天津科技大學(xué)微生物實驗室；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[6]（以5 g豆渣粉計）：葡萄糖0.2 g、（NH4）2SO40.007 5 g、MgSO4·7H2O 0.01 g；葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、濃硫酸、無水乙醇：分析純。

1.2 主要設(shè)備

XFS-280M手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-2102C雙層小容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；756PC紫外可見分光光度計：天津普瑞斯儀器有限公司；MB23水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半固體發(fā)酵試驗

1.3.1.1 豆渣的預(yù)處理

將豆渣（水分約7%）在50℃干燥后進(jìn)行粉碎，過60目篩網(wǎng)后得到豆渣粉，置于4℃冰箱中備用。

將發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，以不同料液比加入蒸餾水，包扎封口，121℃滅菌30 min。待冷卻至室溫后以無菌操作接種羊肚菌種子培養(yǎng)液，25℃、120 r/min條件下，置于振蕩器中培養(yǎng)。

1.3.1.2 半固體發(fā)酵單因素試驗

選取不同的培養(yǎng)基料液比[1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）]、接種量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）和發(fā)酵時間（5、6、7、8、9 d），以水提醇沉法得到的多糖含量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單因素試驗[7]。

1.3.1.3 半固體發(fā)酵優(yōu)化的正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交優(yōu)化試驗，以獲得最佳發(fā)酵條件和最大多糖含量。

1.3.1.4 多糖含量的測定

多糖含量測定采用苯酚硫酸法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]。

樣品預(yù)處理：發(fā)酵完成后，將發(fā)酵物置于50℃烘箱中干燥24 h后，進(jìn)行粉碎，過60目篩網(wǎng)后得到發(fā)酵物干粉。

樣品多糖含量的測定：準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g于燒杯中，按料水比1∶20 g/mL，置于70℃下水提90 min，4 000 r/min離心20 min，上清液過0.45 μm水系濾膜。取1 mL上清液，加入4倍體積無水乙醇，4℃下放置12 h。4 000 r/min離心20 min，取沉淀，溶于10 mL蒸餾水，制得樣液。將樣液稀釋10倍，取1 mL稀釋液，加入6%苯酚（現(xiàn)配）1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，混勻后室溫下靜置20 min，在490 nm波長處測定吸光度值。

1.3.2 多糖的提取

預(yù)處理：將發(fā)酵物干粉用濾紙包好，放于石油醚中浸泡，直至無黃色油脂析出，50℃烘干。取脫脂后的發(fā)酵物干粉用95%乙醇于60℃浸泡1 h后離心15 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，以除去單糖、雙糖、低聚糖等的干擾，50℃烘干[9]。多糖的提取工藝見圖1。

圖1 多糖的提取工藝Fig.1Polysaccharide extraction

1.3.3 結(jié)合膽酸鹽能力評價

1.3.3.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精確稱取無水膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃膽酸鈉3種標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水配制成3種1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

取標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于具塞試管中，加生理鹽水至1 mL，再加入7.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，在387 nm波長處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.3.3.2 CMP結(jié)合膽酸鹽能力評價

用生理鹽水配制樣液，濃度為3 mg/mL。取1 mL的樣液于具塞試管中，加入0.01 mol/L鹽酸溶液1 mL，37℃振蕩消化1 h，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.3，再加入10 mg/mL胰酶4 mL，37℃振蕩消化1 h之后，即得到經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的消化液。取1 mL消化液，加入1mmol/L膽酸鹽溶液4 mL，37℃振蕩2 h，4 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液，加入7.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，在387 nm波長處測定吸光度值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到樣液中結(jié)合的膽酸鹽含量[11]。

1.3.4 體外抗氧化性評價

1.3.4.1 DPPH自由基清除率評價

取0.5 mL濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、10 g/mL的樣液，加入0.025 mg/mL的DPPH乙醇溶液2 mL，充分搖勻后室溫避光放置30 min，然后在517 nm波長處測定吸光度值，抗壞血酸（VC）作陽性對照[6]。DPPH自由基清除率計算公式如式（1）。

式中：A0為用蒸餾水代替樣品測得的吸光度值；A1為樣品測得的吸光度值；A2為用蒸餾水代替DPPH乙醇溶液測得的吸光度值。

1.3.4.2 羥自由基清除率評價

取1.0 mL濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、10 g/mL的樣液置于比色管中，依次加入20 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液0.15 mL，1.5 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，6 mmol/L的H2O2溶液0.35 mL，混勻后在37℃下水浴1h，然后在562nm波長處測定吸光度值，抗壞血酸（VC）作陽性對照[12]。羥自由基清除率計算公式如式（2）。

式中：A0為用蒸餾水代替樣品測得的吸光度值；A1為樣品測得的吸光度值；A2為用蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液測得的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，即培養(yǎng)基料液比1∶9（g/mL），接種量2.5%，發(fā)酵時間8 d，分別選擇料液比1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），接種量2.0%、2.5%、3.0%，發(fā)酵時間7、8、9 d為影響因素和水平，以水提醇沉法得到的多糖含量為標(biāo)準(zhǔn)，選取L9（34）正交表設(shè)計正交試驗。表1為正交試驗影響因素水平表。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果分析采用方差分析法，方差分析表見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2The results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

由表2和表3可知，3個因素對多糖含量的影響的主次順序為：發(fā)酵時間＞料液比＞接種量。A因素以A2水平最適，B因素以B3水平最適，C因素以C3水平最適，因此最佳發(fā)酵條件為：料液比1∶9（g/mL），接種量3.0%，發(fā)酵時間9 d。料液比和發(fā)酵時間對多糖含量有較為顯著的影響，接種量也有影響，顯著性低于料液比和發(fā)酵時間[13]。較高的接種量和較長的發(fā)酵時間有利于發(fā)酵過程中羊肚菌的生長，較低的料液比可以防止一定程度的雜菌污染，有利于發(fā)酵過程的進(jìn)行。

2.3 優(yōu)化條件的驗證

因為由正交試驗優(yōu)化出的發(fā)酵條件在正交試驗表中沒有出現(xiàn)，所以需要進(jìn)行補充驗證試驗，驗證試驗的結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4Validation experiment results

結(jié)果顯示該條件下得到的發(fā)酵物中多糖含量是最高的，說明通過正交試驗優(yōu)化得到的最優(yōu)條件是有效的。

2.4 CMP結(jié)合膽酸鹽能力的評價

繪制的無水膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，脫氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖2 無水膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2Standard curve of binding sodium cholate capacity

圖3 脫氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3Standard curve of binding sodium deoxycholate capacity

圖4 牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4Standard curve of binding sodium taurocholate capacity

由圖2～圖4可以知道，3種膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線在一定濃度范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

CMP對各種膽酸鹽結(jié)合能力比較見表5。

表5 CMP對各種膽酸鹽結(jié)合能力比較Table 5Binding capacity of CMP towards the different sodium cholates

由表5可以看出，樣品對3種膽酸鹽都有結(jié)合效果，其中脫氧膽酸鈉的結(jié)合量最高，可達(dá)到（0.16± 0.02）mmol/L。這可能是因為脫氧膽酸鈉的羧基在經(jīng)腸胃模擬環(huán)境處理后的消化液中更易離子化，其活性基團(tuán)更易暴露出來，與CMP發(fā)生疏水鍵、靜電力和氫鍵間的相互作用，其中氫鍵間相互作用可能是主要的作用形式[14]。CMP表現(xiàn)出對各種膽酸鹽的強結(jié)合作用，可以初步證明它有降血脂功能。

2.5 CMP體外抗氧化性的評價

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率見圖5。

圖5 CMP對DPPH自由基的清除率Fig.5Scavenging activity of CMP against DPPH free racdical

由圖5可以看出，在濃度為0.5 mg/mL～10 mg/mL的范圍內(nèi)，CMP的DPPH自由基清除率隨著濃度的升高而增大。當(dāng)濃度為10 mg/mL時，VC和CMP的清除率分別為95.8%和40.9%，表明CMP對DPPH自由基有一定的清除能力。

2.5.2 羥自由基清除率

羥自由基清除率見圖6。

圖6 CMP對羥自由基的清除率Fig.6Scavenging activity of CMP against hydroxy free racdical

羥自由基是人體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，它會誘導(dǎo)許多病理變化。由圖6可知，在測定濃度范圍內(nèi)，樣品對羥自由基的清除率隨濃度增大而增大。在濃度為10 mg/mL時，VC和樣品的清除率分別為99.5%和98.9%，樣品對羥自由基的清除能力略低于VC。

3 結(jié)論

以豆渣為培養(yǎng)基，研究羊肚桿菌半固體發(fā)酵豆渣生產(chǎn)多糖的工藝條件，在料液比1∶9（g/mL），接種量3.0%，發(fā)酵時間9 d的最優(yōu)條件下，多糖含量達(dá)到8.86%，這為用羊肚桿菌大規(guī)模低成本的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了參考和理論數(shù)據(jù)，也為豆渣的再利用提供了新思路。還對CMP的功能性進(jìn)行研究，證明CMP具有一定的抗菌性和較高的抗氧化性。

[1]J W C Wong,K F Mak,N W Chan,et al.Co-composting of soybean residues and leaves in Hong Kong[J].Bioresource Technology,2001, 76(2)：99-106

[2]Jeng-Leun Mau,Chieh-No Chang,Shih-Jeng Huang,et al.Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa, Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[J]. Food Chemistry,2004,87(1)：111-118

[3]宋淑敏,皺作華,王洪蔭,等.EF-11營養(yǎng)液的研制及其保健作用的試驗研究[J].食品科學(xué),1996,17(7)：52-57

[4]胡克興,董雪,范黎.羊肚菌屬分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2004,31(6)：115-119

[5]白晨,王淑珍,陸文蔚,等.用于健康食品生產(chǎn)的羊肚菌發(fā)酵條件的研究[J].食用菌,2010,32(1)：17-19

[6]Li Shuhong,Sang Yaxin,Zhu Dan,et al.Optimization of fermentation conditions for crude polysaccharides by Morchella esculenta using soybean curd residue[J].Industrial Crops and Products,2013,50： 666-672

[7]韓勇.冬蟲夏草發(fā)酵小麥麥麩生產(chǎn)蟲草多糖及分離純化研究[D].天津：天津科技大學(xué),2015

[8]中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 15672-2009食用菌中總糖含量的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009：1-2

[9]萬艷娟,劉曉娟,趙力超,等.南瓜多糖抑制α-淀粉酶及抑菌活性的研究[J].食品科技,2012,37(3)：44-47

[10]辛勛,陸紅云.紫外分光光度法測定速效傷風(fēng)膠囊中膽酸含量[J].中國藥業(yè),2000,9(1)：36-37

[11]程麗敏.金花葵莖可溶性糖的提取及性質(zhì)研究[D].天津：天津科技大學(xué),2016

[12]Li Xiaoyu,Wang Lu.Effect of extraction method on structure and antioxidant activity of Hohenbuehelia serotina polysaccharides[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,83：666-672

[13]黃燕,吳平.SAS統(tǒng)計分析及應(yīng)用[M].北京：機械工業(yè)出版社.2006：251-255

[14]Danuta G,Jozef K.Sorption of bile acids and cholesterol by dietary fiber of carrots,cabbage and apples[J].International Food Science and Technology,2002,5(2)：148-150

Utilization of Soybean Curd Residue for Polysaccharides Production by Morchella esculenta and Evaluation of the Functional Properties

YAO Heng，ZHU Hui，CHEN Ye，LI Shu-hong*
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The semisolid fermentation by Morchella esculenta using soybean curd residue was studied.Orthogonal experimental design was employed to optimize the fermentation conditions.The optimal fermentation condi tions achieved for crude polysaccharide production 8.86%were feed liquid ratio 1∶9（g/mL），inoculum size 3.0%and fermentation time 9 days，respectively.The crude polysaccharide（CMP）was extracted from the fermentation substrate，then the function of CMP was evaluated.The results on the ability of bile salt-binding showed that CMP had binding capacities for three kinds of cholates（anhydrous cholate，deoxycholate，taurocholate），which demonstrated that CMP had hypolipidemic effect.Meanwhile，CMP exhibited a positive antioxidant activity.

Morchella esculenta；semisolid fermentation；polysaccharides；functional properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.033

2016-08-13

姚珩（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：李書紅，女，講師。