薛秀蕾，范小波，吳國球

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

結(jié)締組織生長因子CT結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及分離純化

薛秀蕾1，范小波1，吳國球2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

目的：構(gòu)建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)重組CTGF- CT的可溶性表達(dá)及分離純化，以用于制備CTGF- CT抗體。方法：基因合成CTGF- CT序列，利用NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后插入pET32a載體，構(gòu)建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.colistrain BL21(DE3)細(xì)胞，通過異丙基β- D- 硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)獲得重組融合蛋白，利用鎳柱親和純化及腸激酶酶切純化獲得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE鑒定蛋白純度并進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果：所構(gòu)建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒驗(yàn)證正確。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了與預(yù)期分子量(28 kD)一致的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)腸激酶切割及兩次鎳柱親和純化獲得目的蛋白CTGF- CT，純化后純度約95%，Western blotting分析表明純化目的蛋白為CTGF- CT。結(jié)論：通過構(gòu)建原核pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了重組CTGF- CT蛋白的表達(dá)及分離純化，為CTGF- CT抗體的制備和CTGF- CT功能的深入研究打下了基礎(chǔ)。

結(jié)締組織生長因子； 原核表達(dá)； 蛋白純化

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是高度保守的即刻早期基因(CCN)多肽家族成員之一，在細(xì)胞增殖、合成膠原、介導(dǎo)細(xì)胞黏附和趨化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管和肉芽組織形成等多方面均發(fā)揮著重要作用[1]。CTGF蛋白有4個功能結(jié)構(gòu)域[2]，依次為胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白區(qū)(IGFBP)、VWF(von willebrand factor)因子的C型重復(fù)區(qū)(VWC)、血小板反應(yīng)蛋白I型(TSP- 1)重復(fù)區(qū)和富含半胱氨酸的C末端(CT區(qū))。其中，CT結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合相關(guān)[2]。越來越多的研究表明，CT結(jié)構(gòu)域在誘導(dǎo)細(xì)胞黏附[3]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[4]、信號通路激活[5- 6]等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

本研究目的主要是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建CTGF- CT原核表達(dá)載體表達(dá)純化融合蛋白，并經(jīng)過鎳親和層析純化融合蛋白、腸激酶酶切回收等步驟制備目的蛋白CTGF- CT，經(jīng)SDS- PAGE、ELISA和Western blotting等分析鑒定所制備的重組CTGF- CT蛋白，為CTGF- CT抗體的制備提供良好的抗原，同時為CTGF- CT的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 載體和菌株

E.colistrain BL21(DE3)菌株購自New England Biolabs公司(Beverly MA,USA)，pET32a質(zhì)粒載體購自Novagen公司(Madison Wisconsin,USA),pET32a- TrxA- His- CTGF- CT載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(NcoI和XhoI等)及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；抗- CTGF單克隆抗體購自R&D SYSTEMS；抗鼠HRP- IgG抗體購自Jackson Imm- unoResearch Laboratories；TRYPTONE(胰蛋白胨)、YEAST EXTRACT(酵母提取物)等發(fā)酵培養(yǎng)基成分均來源于OXOID公司；異丙基β- D- 硫代半乳糖(IPTG)、腸激酶、氨芐青霉素、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖泻蚇i- IDA親和層析介質(zhì)來源于南京金斯瑞生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品來源于Thermo Fisher Scientific；透析袋和超濾管購自Millipore公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究中心；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CTGF- CT基因的合成及pET32a- CTGF- CT表達(dá)載體的構(gòu)建

利用GenBank檢索并下載人CTGF基因序列(ACCESSION:CR541734.1)，根據(jù)其中CTGF- CT序列和大腸桿菌密碼子偏愛性得到cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物并基因合成目的CTGF- CT序列，引物F：GATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAA；引物R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGCCATGTCTCCGTACATCTTC。基因合成產(chǎn)物和pET32a載體用NcoI和XhoI限制內(nèi)切酶酶切，連接兩個片段組成原核表達(dá)載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.colistrain BL21(DE3)，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證。pET32a- CTGF- CT表達(dá)載體構(gòu)建示意圖見圖1。

圖1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2 CTGF- CT蛋白的表達(dá)及純化

將pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.colistrain BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至5 ml含100 mg·ml-1Amp的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h作為種子液，次日按照1 ∶100的比例接種于200 ml含Amp(100 mg·ml-1)的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃ 220 r·min-1培養(yǎng)2～3 h至OD600值為0.6～0.8，取1 ml培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前對照樣品；向剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，20 ℃ 160 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，收集菌體。每克濕重的菌體加入5 ml細(xì)菌裂解液(100 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O,10 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)進(jìn)行充分懸浮，冰浴下超聲波破碎菌體后4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，將收集的上清樣品用Ni- IDA親和層柱進(jìn)行純化獲得融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)，BCA法對可溶表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行定量檢測。透析后融合蛋白樣品加入酶切緩沖液后每1 mg目的蛋白加入2 U腸激酶，4 ℃酶切10 h，利用TrxA- His與CTGF- CT標(biāo)簽的差異性特點(diǎn)再次利用鎳柱純化并分離獲得目的蛋白(CTGF- CT)，BCA法進(jìn)行定量，收集目的蛋白冷凍干燥后保存。上述原核表達(dá)及純化過程中得到的樣品均進(jìn)行SDS- PAGE分析。

2.3 重組蛋白CTGF- CT的分析

CTGF- CT目的蛋白的Western blotting檢測：根據(jù)目的蛋白分子量，采用10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS- PAGE凝膠電泳，冰浴下恒流200 mA，電轉(zhuǎn)移1 h；封閉后加入抗CTGF單克隆抗體(1∶1 500)，置振蕩器孵育，4 ℃過夜后PBST漂洗濾膜4次；將PVDF膜置于羊抗鼠HRP-IgG抗體(1∶1 500)溶液中，室溫下?lián)u蕩標(biāo)記1.5h后PBST漂洗濾膜5次；ECL顯色觀察結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒的鑒定

利用NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶對引物F、引物R所合成基因產(chǎn)物和pET32a載體同時進(jìn)行雙酶切，連接回收后片段構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。將陽性轉(zhuǎn)化克隆中所提取質(zhì)粒利用NcoI和XhoI雙酶切，結(jié)果在圖2中可見大小分別為5 kb和400 bp左右的條帶，其中400 bp左右的條帶為特征性片段。同時，DNA測序證實(shí)CTGF- CT閱讀框正確無誤，表明pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT質(zhì)粒; 2. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT質(zhì)粒雙酶切

圖2 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達(dá)載體的酶切鑒定

3.2 CTGF- CT蛋白的表達(dá)及純化

將IPTG(0.5 mmol·L-1)誘導(dǎo)表達(dá)1、2、4、6、8 h后的菌體裂解后超聲破碎，離心后所獲上清和沉淀分別進(jìn)行SDS- PAGE分析，結(jié)果顯示在28 kD左右有目標(biāo)重組蛋白表達(dá)且與融合蛋白理論分子量相符，重組融合蛋白的表達(dá)大部分以可溶性形式存在于上清(圖3)。利用BCA法測得融合蛋白在3次洗脫液中的濃度分別為2.63、1.36和1.13 mg·ml-1，3次洗脫液體積分別為500、400和300 μl，計(jì)算得出1 L菌液共收獲6.20 mg可溶融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)。

重組表達(dá)載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT的構(gòu)建是在pET32a(+)載體上利用NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)插入目的蛋白CTGF- CT基因，使其以TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白的形式表達(dá)。利用His- Tag與Ni- IDA親和層析介質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行融合蛋白的純化簡便有效，融合蛋白進(jìn)行Western blotting分析(圖4 Lane 2)。經(jīng)腸激酶酶切后融合蛋白被酶切為TrxA- His和CTGF- CT，酶切反應(yīng)液利用固定金屬親和層析(IMAC)進(jìn)一步純化，從凝膠層析流出液中收集目的CTGF- CT蛋白(圖5 Lane 2)，BCA法蛋白定量檢測計(jì)算得出1 L菌液共收獲2.31 mg目的蛋白CTGF- CT。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品; 1.未加誘導(dǎo)劑菌體對照; 2～6.誘導(dǎo)1、2、4、6和8 h菌體超聲后上清

圖3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的SDS- PAGE分析

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品; 1.純化的CTGF- CT; 2.純化的融合蛋白

圖4 融合蛋白及目的蛋白純化后Western blotting分析

3.3 重組蛋白CTGF- CT的分析

利用直接ELISA檢測純化所得CTGF C端CT區(qū)即CTGF- CT的活性(圖6)，Western blotting鑒定純化所獲蛋白(圖4 Lane 1)。

4 討 論

CTGF(CCN2)是由349個氨基酸殘基組成的分泌性多肽，分子量為36～38 kDa。CTGF可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[7- 8]及細(xì)胞外基質(zhì)的形成[2]，在介導(dǎo)細(xì)胞黏附[1]、遷移[9]、炎癥[10- 11]及促進(jìn)血管形成中發(fā)揮廣泛的作用[1- 2]。CTGF的C端即CT區(qū)功能結(jié)構(gòu)域在促進(jìn)細(xì)胞黏附[3,12]、激活促炎癥因子[6]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[4]、激活信號通路[5]、直接介導(dǎo)CTGF與整合素受體之間的結(jié)合[13]等方面發(fā)揮重要作用。因此，本研究關(guān)注CTGF的C端結(jié)構(gòu)域即CT區(qū)(CTGF- CT)的表達(dá)純化，制備生產(chǎn)足量優(yōu)質(zhì)的CTGF- CT重組蛋白，以利于后續(xù)相關(guān)特異性抗體研究和功能研究。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品; 1、6.未加誘導(dǎo)劑對照; 2.腸激酶切割液上鎳柱后流出液;3.腸激酶切割液; 4.鎳柱純化的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT; 5.誘導(dǎo)后菌體蛋白; 7.腸激酶切割液上鎳柱后洗脫液

圖5 融合蛋白及目的蛋白純化的SDS- PAGE分析

圖6 ELISA檢測表達(dá)蛋白的活性

E.coli系統(tǒng)遺傳圖譜明確、操作簡便易行、生產(chǎn)成本較低，且對許多蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的耐受力，是許多重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中，融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)可提高目的蛋白的產(chǎn)量、減少蛋白質(zhì)的錯誤折疊和包涵體的形成、方便后續(xù)分離純化。本實(shí)驗(yàn)選用IPTG誘導(dǎo)啟動子表達(dá)載體(pET32a)，構(gòu)建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表達(dá)載體，CTGF- CT目的蛋白N端融合硫氧還蛋白(TrxA)并引入組氨酸標(biāo)簽，方便進(jìn)行重組蛋白CTGF- CT的體外表達(dá)及純化，以期獲得可溶表達(dá)的重組蛋白。分子伴侶TrxA的引入可以幫助外源蛋白成功表達(dá)、降低宿主細(xì)胞對外源蛋白的降解從而可以大大提高蛋白表達(dá)產(chǎn)量、可溶性[14]及穩(wěn)定性[15]；利用組氨酸標(biāo)簽與Ni2+相互作用進(jìn)行親和層析純化，簡便有效；pET32a帶有pBR322的大腸菌素E1(colE1)復(fù)制區(qū)，賦予宿主菌氨芐青霉素抗性，有利于陽性克隆子的篩選；為方便后續(xù)純化，pET32a載體中XhoI酶切位點(diǎn)后的His- Tag已去除，僅保留Trx- Tag后的His- Tag。本研究所構(gòu)建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到純度大于90%的可溶性TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白，在大腸桿菌成功表達(dá)。SDS- PAGE結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白表達(dá)位于28 kD處，這與融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的理論分子量一致，且大部分為可溶蛋白表達(dá)形式。

本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的N- 末端連接有His標(biāo)簽，利用鎳親和層析柱純化融合蛋白，結(jié)果顯示融合蛋白純度達(dá)90%以上；TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白中His- Tag與CTGF- CT間為腸激酶酶切位點(diǎn)，利用腸激酶的識別酶切對融合蛋白進(jìn)行切割，利用鎳親和層析對酶切反應(yīng)液再次進(jìn)行分離純化即可獲得目的蛋白CTGF- CT。從圖4 SDS- PAGE結(jié)果中Lane 4、Lane 5和Lane 7可以看出融合蛋白被腸激酶識別切割；酶切下的CTGF- CT不含His- Tag，因此在融合蛋白第2次鎳親和層析純化過程中，可在流穿液中收集即可獲得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE分析顯示其純度大于95%。利用上述純化方法可在1 L菌液中獲得毫克級別的重組蛋白。ELISA檢測結(jié)果顯示，融合蛋白與Anti- CTGF具有良好的結(jié)合活性；去除TrxA、His等氨基酸后CTGF- CT與Anti- CTGF結(jié)合未受影，仍具有良好的結(jié)合活性。同時Western blotting分析驗(yàn)證了融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT和目的蛋白CTGF- CT。

因此，我們純化得到了理想的CTGF- CT蛋白，可用于后續(xù)相關(guān)研究工作，同時為進(jìn)一步研究CTGF- CT的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] PERBAL B.CCN proteins:multifunctional signalling regulators[J].Lancet,2004,363(9402):62- 64.

[2] SHI- WEN X,LEASK A,ABRAHAM D.Regulation and function of connective tissue growth factor/CCN2 in tissue repair,scarring and fibrosis[J].Cytokine Growth Factor Rev,2008,19(2):133- 144.

[3] GAO R,BRIGSTOCK D R.Connective tissue growth factor(CCN2) induces adhesion of rat activated hepatic stellate cells by binding of its C- terminal domain to integrin alpha(v)beta(3) and heparan sulfate proteoglycan[J].J Biol Chem,2004,279(10):8848- 8855.

[4] BLEAU A M,PLANQUE N,LAZAR N,et al.Antiproliferative activity of CCN3:involvement of the C- terminal module and post- translational regulation[J].J Cell Biochem,2007,101(6):1475- 1491.

[5] STEPHENS S,PALMER J,KONSTANTINOVA I,et al.A functional analysis of Wnt inducible signalling pathway protein- 1(WISP- 1/CCN4)[J].J Cell Commun Signal,2015,9(1):63- 72.

[6] RODRIGUES- DIEZ R R,GARCIA- REDONDO A B,OREJUDO M,et al.The C- terminal module Ⅳ of connective tissue growth factor,through EGFR/Nox1 signaling,activates the NF- kappaB pathway and proinflammatory factors in vascular smooth muscle cells[J].Antioxid Redox Signal,2015,22(1):29- 47.

[7] IVKOVIC S,YOON B S,POPOFF S N,et al.Connective tissue growth factor coordinates chondrogenesis and angiogenesis during skeletal development[J].Development,2003,130(12):2779- 2791.

[8] 周曉明，毛幸，吳小濤.Yes相關(guān)蛋白在腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2016,44(4):561- 564.

[9] AGUIAR D P,de FARIAS G C,de SOUSA E B,et al.New strategy to control cell migration and metastasis regulated by CCN2/CTGF[J].Cancer Cell Int,2014,14:61.

[10] MIYASHITA T,MORIMOTO S,FUJISHIRO M,et al.Inhibition of each module of connective tissue growth factor as a potential therapeutic target for rheumatoid arthritis[J].Autoimmunity,2016,49(2):109- 114.

[11] NOZAWA K,FUJISHIRO M,TAKASAKI Y,et al.Inhibition of rheumatoid arthritis by blocking connective tissue growth factor[J].World J Orthop,2014,5(5):653- 659.

[12] BALL D K,RACHFAL A W,KEMPER S A,et al.The heparin- binding 10 kDa fragment of connective tissue growth factor(CTGF) containing module 4 alone stimulates cell adhesion[J].J Endocrinol,2003,176(2):R1- 7.

[13] HOSHIJIMA M,HATTORI T,INOUE M,et al.CT domain of CCN2/CTGF directly interacts with fibronectin and enhances cell adhesion of chondrocytes through integrin alpha5beta1[J].FEBS Lett,2006,580(5):1376- 1382.

[14] HUANG L,LEONG S S,JIANG R.Soluble fusion expression and characterization of bioactive human beta- defensin 26 and 27[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,84(2):301- 308.

[15] MCCOY J,LAVILLE E.Expression and purification of thioredoxin fusion proteins[M].Massachusetts:John Wiley & Sons,Inc.,2001:16.8.1- 16.8.13.

(本文編輯：周蘭波)

Prokaryotic expression and purification of connective tissue growth factor(CT domain) inE.coli

XUE Xiu- lei1,FAN Xiao- bo1,WU Guo- qiu2

(1.MedicalSchoolofSoutheatUniversity,Nanjing210009,China; 2.ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective: To construct the recombinant pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid and to express and purify CT domain of connective tissue growth factor(CTGF) in order to prepare CTGF- CT polyclonal antibody. Methods: The nucleotide sequence encoding CTGF- CT was chemically synthesized and inserted into the pET- 32a(+) vector. The constructed pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid was transformed intoE.colistrain BL21(DE3). And the TrxA- CTGF- CT fusion protein was induced expression by IPTG; Then CTGF- CT was purified by enterokinase cleavage and Ni- NTA purification and was identified by SDS- PAGE and Western blotting. Results: The authenticity of the recombinant pET32a- TrxA- CTGF- CT- His plasmid was verified by DNA sequencing and it was identified containning a 400 bp fragment byNcoI andXhoI double digestion. The molecular weight of TrxA- CTGF- CT was about 28 kD after IPTG induced expression. After enterokinase cleavage and Ni- NTA purification, the CTGF- CT was obtained as expected molecular weight of 14 kD. Western blotting proved that the protein was CTGF- CT. The purity of the recombinant CTGF- CT was about 95%. Conclusion: The construction of pET32a- TrxA- His- CTGF- CT and the expression and purification of CTGF- CT are successfully achieved. That will lay the foundations for preparation of CTGF- CT antibody and the further study on the function of CTGF- CT.

connective tissue growth factor; prokaryotic expression; protein purification

2016- 09- 08

2016- 12- 06

薛秀蕾(1984-)，女，山東聊城人，醫(yī)學(xué)博士。E- mail: xiulei_xue@163.com

吳國球 E- mail: nationball@163.com

薛秀蕾,范小波,吳國球. 結(jié)締組織生長因子CT結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及分離純化[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2017,36(2):230- 234.

R- 33; R393

A

1671- 6264(2017)02- 0230- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.020