于澤奇+武慧麗+涂悅+衣泰龍+楊小颯+張賽+程世翔

[摘要] 目的 探討受體相互作用蛋白3（RIP3）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其對U251細(xì)胞增殖的影響。 方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time RT-PCR）法分別檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤A172、U251、U373和U87細(xì)胞中RIP3的表達(dá)水平，隨后應(yīng)用U251穩(wěn)定過表達(dá)RIP3（U251-RIP3）細(xì)胞模型，分別采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)細(xì)胞周期變化。結(jié)果 RIP3 mRNA在4株膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U373、U87）中均有表達(dá)，并在U251細(xì)胞中表達(dá)最低。real-time RT-PCR結(jié)果表明U251-RIP3細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)RIP3，與陰性對照（空載）（NC）相比，RIP3過表達(dá)能夠抑制U251細(xì)胞增殖能力；能夠降低U251細(xì)胞克隆形成能力，培養(yǎng)11 d后細(xì)胞集落數(shù)目（67±2）較NC（75±3）減少（P < 0.05）；能夠延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，U251-RIP3細(xì)胞的S期比例較NC組（16.0±0.4）%升至（18.2±1.0）%（P < 0.05），同時(shí)G0/G1期比例較NC組（55.7±0.5）%降至（57.4±0.4）%（P < 0.01）。 結(jié)論 RIP3過表達(dá)后可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，有望成為靶向控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的潛在治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 受體相互作用蛋白3；膠質(zhì)瘤；細(xì)胞增殖；可控性壞死

[中圖分類號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the expressive changes of RIP3 in all sorts of glioma cell lines and the effects on the cell proliferation in the U251 cells. Methods The expression levels of RIP3 mRNA in the four glioma cell lines （A172， U251， U373 and U87） were firstly selected by real-time RT-PCR. Then， U251 cells were engineered to overexpress RIP3 for further study. Lastly， the MTT， colony formation， and flow cytometry assays were used to detect the effects of RIP3 on the cell proliferation， clone formation， and cell cycle of U251 cells， respectively. Results The expression levels of RIP3 mRNA was detected in all four glioma cell lines， and the lowest level of it was discovered in U251 cell line. Then， real-time RT-PCR assay showed that RIP3 was successfully overexpressed in U251-RIP3 cells compared with negative control （NC） cells with empty vector. The overexpressed RIP3 altered the cell viability in U251 cells， Additionally， the overexpressed RIP3 also reduced the colony formation of U251 cells： after 11 d of cell culture， the colony number of U251-RIP3 cells （67±2） was significantly decreased compared with that of NC cells （75±3） （P < 0.05）. Correspondingly， the proportion of U251-RIP3 cells in S phase arrest was higher than that in NC cells [from （16.0±0.4）% to （18.2±1.0）% ] （P < 0.05）. Meanwhile， that in G0/G1 phase was reduced compared with that in NC cells [from （57.4±0.4）% to （55.7±0.5）%] （P < 0.01）. Conclusion Studies suggested that the overexpression of RIP3 could confer inhibition to the cell proliferation in glioma U251 cells； and it indicated that RIP3 may be as a potential target for glioma chemotherapy.

[Key words] Receptor-interacting protein 3； Glioma； cell proliferation； Regulated necrosis

腦腫瘤占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的90%以上[1]，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤（gliomas）是最常見的腦腫瘤。近20年來，膠質(zhì)瘤患者中位生存期無明顯改善，其高復(fù)發(fā)率成為治療的最大難題[2]。隨著醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，使我們對腫瘤的發(fā)生機(jī)制有了更深入的了解，同時(shí)也提供了腫瘤治療的新策略和新手段，其中基因治療被認(rèn)為是前景廣闊的一種治療方式，已成為神經(jīng)科學(xué)中最富挑戰(zhàn)而又亟待解決的課題。

受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）是受體相互作用蛋白家族（RIPs）的重要成員。激活狀態(tài)下的RIP3 能夠調(diào)控細(xì)胞可控性壞死以及炎癥的發(fā)生[3]。研究表明，RIP3在丘腦、黑質(zhì)、胼胝體、殼核、延髓和脊髓中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，提示RIP3可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和疾病進(jìn)程中扮演著重要角色[4]。近年來，RIP3在多種腫瘤（例如肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等）中發(fā)揮的重要作用受到廣泛關(guān)注[5-7]，然而，RIP3對腫瘤細(xì)胞的功能影響尚存在爭議。本研究旨在探討RIP3在各種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為其在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172、U251、U373、U87購自美國ATCC公司，常規(guī)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

CO2恒溫三氣培養(yǎng)箱（150i，美國Thermo），倒置顯微鏡（TS100-LED MV，日本Nikon），Real time PCR 儀器（LightCycler 480 II，德國Roche），酶標(biāo)儀（1510，美國Thermo），流式細(xì)胞儀（FACSCallibur，美國BD）；Trizol試劑（美國Invitrogen），M-MLV、dNTPs（美國Promega），oligo dT（上海生工），RNAase Inhibitor（美國Promega），Primer（上海生工），SYBR？誖 Premix Ex Taq（大連寶生物工程有限公司），MTT、DMSO、Giemsa染色液、PI（美國Sigma），RNase A（康為世紀(jì)公司），凋亡試劑盒（美國eBioscience）。

1.3 引物設(shè)計(jì)和RIP3重組載體構(gòu)建

RIP3基因上游引物：5′-TGG CGG TCA AGA TCG TAA ACT C-3′，下游引物5′-TTC TGG TCG TGC AGG TAA AAC A-3′，長度265 bp；GAPDH基因上游引物：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游引物5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′，長度121 bp。采用Age I和EcoR I酶切目的片段和慢病毒載體（GeneChem），通過T4 DNA連接酶將其在NE Buffer中16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)并涂板。PCR鑒定陽性重組子，DNA測序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h。收集上清液，經(jīng)濃縮過濾后獲得濃縮病毒液，分裝，-80℃保存。

1.4 real-time RT-PCR法檢測RIP3 mRNA表達(dá)水平

用Trizol試劑盒提取四株膠質(zhì)瘤細(xì)胞總RNA，使用M-MLV試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：42℃水浴反應(yīng)1 h，70℃水浴10 min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，將得到的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。再以此cDNA為模板進(jìn)行real-time RT-PCR，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40次循環(huán)，72℃ 10 min。RIP3基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt 方法計(jì)算。

1.5 U251細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，按（3～5）×104個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待融合度約為40%時(shí)更換含有RIP3慢病毒載體的維持液，維持液中感染復(fù)數(shù)（MOI）為10、16 h后將各孔中細(xì)胞收集到干凈的1.5 mL EP管中，2000 r/min離心2 min，去掉上清液，更換為完全培養(yǎng)基，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。感染后72 h更換含濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，細(xì)胞存活即為陽性感染。實(shí)驗(yàn)分設(shè)U251-RIP3和陰性對照（空載）（NC）。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，按每孔2000個(gè)接種于96 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。檢測時(shí)間點(diǎn)終止前4 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT于孔中，無需換液。4 h后完全吸去培養(yǎng)液，加100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。振蕩器振蕩2～5 min，酶標(biāo)儀490 nm檢測OD值。

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，按每孔細(xì)胞1000個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后2 h，在孔內(nèi)分別加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育11 d后，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞60 min，洗滌后每孔加入Giemsa染液500 μL，染色30 min，洗滌晾干后拍照計(jì)數(shù)。

1.8 細(xì)胞周期分析

收集各組U251細(xì)胞，1000 r/min離心5 min后，棄上清，加入預(yù)冷PBS液4 mL，反復(fù)吹打，1000 r/min再離心5 min。反復(fù)沖洗3次后，用75%冰乙醇固定細(xì)胞，-20℃過夜。將固定好的細(xì)胞用PBS洗滌離心后，再用500 μL PBS將細(xì)胞重懸，分別加入50 μg/mL碘化丙啶（PI）和100 μg/mL RNase A。37℃避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用非配對樣本t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U251-RIP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立

采用real-time RT-PCR法檢測了RIP3 mRNA在4株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U373和U87）中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖1A），U373細(xì)胞中RIP3 mRNA表達(dá)水平最高，而U251細(xì)胞表達(dá)最低。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇U251細(xì)胞為模型，通過構(gòu)建的RIP3過表達(dá)重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，結(jié)果表明（圖1B），與NC比較，U251-RIP3組中RIP3表達(dá)顯著升高（P < 0.01），提示U251-RIP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.2 過表達(dá)RIP3降低U251細(xì)胞增殖能力

采用MTT法檢測RIP3對U251細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示：在檢測的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，U251-RIP3 細(xì)胞生長速度明顯低于NC[1 d：（0.15±0.00）比（0.20±0.00），2 d：（0.24±0.01）比（0.35±0.01，3 d：（0.40±0.05）比（0.565±0.06），4 d：（0.59±0.08）比（0.89±0.07），5 d：（1.33±0.07）比（1.57±0.08）； P < 0.01或P < 0.05。見圖2]，提示RIP3能夠抑制U251細(xì)胞增殖。

2.3 過表達(dá)RIP3降低U251細(xì)胞克隆形成能力

采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測RIP3對U251細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)11 d后，U251-RIP3 細(xì)胞集落數(shù)目（67±2）較NC（75±3）減少（P < 0.05，圖3A），而且形成的集落中細(xì)胞數(shù)目減少（圖3B），提示RIP3能夠降低U251細(xì)胞的克隆形成能力。

2.4 過表達(dá)RIP3延緩U251細(xì)胞周期進(jìn)程

采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)RIP3對U251細(xì)胞周期的影響（圖4）。與NC比較（表1），U251-RIP3組細(xì)胞可降低G0/G1期細(xì)胞比例，由（57.4±0.4）%降至（55.7±0.5）%（P < 0.01），同時(shí)升高S期細(xì)胞比例，由（16.0±0.4）%升至（18.2±1.0）%（P < 0.05），而G2/M期變化無差異，提示RIP3使U251細(xì)胞阻滯于S期，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制U251細(xì)胞增殖。

3 討論

近年來研究研究表明，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和耐藥與腫瘤細(xì)胞的可控性壞死密切相關(guān)[3]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，壞死是在強(qiáng)烈的外界刺激下發(fā)生的被動(dòng)病理過程。后續(xù)研究證實(shí)，細(xì)胞壞死可受死亡信號(hào)通路的調(diào)控，2005年Degterev等[8]首次將這種可受調(diào)控的細(xì)胞壞死稱為壞死性凋亡（necroptosis），其中RIP3是壞死性凋亡通路中的核心分子。

RIP3是受體相互作用蛋白家族的成員之一，具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其獨(dú)特的C端能夠感受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，精細(xì)調(diào)控細(xì)胞死亡和存活[9]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，RIP3在腦、心、肝、腎等正常組織中均有廣泛表達(dá)[10]，而在肝癌、肺癌等內(nèi)都是低表達(dá)狀態(tài)[11-12]，而且RIP3多定位于腫瘤相關(guān)的染色體14q11.2區(qū)[13]，這提示RIP3可能與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能聯(lián)系密切。為此，本實(shí)驗(yàn)首先利用慢病毒載體構(gòu)建RIP3穩(wěn)定過表達(dá)U251細(xì)胞株。該方法具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能感染分裂期或非分裂期細(xì)胞，可將外源RIP3基因整合入U(xiǎn)251細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)，是基因治療中強(qiáng)有力的工具。

目前研究認(rèn)為，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖與死亡平衡功能失調(diào)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)RIP1-RIP3復(fù)合體能夠調(diào)控放療誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可控性壞死的發(fā)生[14]。然而，另有報(bào)道顯示，RIP1、RIP3卻在乳腺癌細(xì)胞增殖中扮演了促進(jìn)角色[15]，這提示RIP3介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死性凋亡可能在不同類型腫瘤中發(fā)生“雙刃劍”作用。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討RIP3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中所發(fā)揮的作用。結(jié)果表明，過表達(dá)RIP3能夠降低U251細(xì)胞增殖能力、降低細(xì)胞克隆形成、延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)RIP3在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，并深入探討了過表達(dá)RIP3在U251細(xì)胞中的生物學(xué)功能，這為臨床靶向治療膠質(zhì)瘤提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-15 本文編輯：蘇 暢）