孫慧葉，孫大慶，魏玉龍

牛乳中頭孢噻呋殘留檢測(cè)方法的研究

孫慧葉1，*孫大慶2，魏玉龍2

（1.集賢縣職業(yè)學(xué)校，黑龍江雙鴨山155900；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)牡丹江食品與生物技術(shù)創(chuàng)新研究院，黑龍江牡丹江157000）

采用TTC法、微生物抑制紙片法和HPLC法對(duì)牛乳中頭孢噻呋殘留進(jìn)行檢測(cè)，比較不同檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果表明，TTC法檢測(cè)頭孢噻呋殘留的檢出限為0.10mg/L；微生物抑制紙片法的檢出限為0.01mg/L，符合限量要求；HPLC法的檢出限為0.10μg/L。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，TTC法簡(jiǎn)單、快速，不需要特殊設(shè)備，適合養(yǎng)殖場(chǎng)和基層使用；HPLC法靈敏度、準(zhǔn)確度高，適合于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)使用。

牛乳；頭孢噻呋；微生物抑制法；高效液相色譜

隨著抗生素在乳畜飼養(yǎng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，牛乳中抗生素殘留問(wèn)題日益受到國(guó)際社會(huì)的重視。頭孢噻呋是美國(guó)于20世紀(jì)80年代成功開(kāi)發(fā)的獸醫(yī)專(zhuān)用第3代頭孢菌素，該藥自上市以來(lái)，由于其優(yōu)良的抗菌活性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，常用于奶牛感染的防治[1]。尋求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的檢測(cè)方法可滿(mǎn)足日趨嚴(yán)格的殘留限量要求，對(duì)保障人們飲用牛乳的衛(wèi)生和安全具有重要現(xiàn)實(shí)意義[2]。國(guó)外采用微生物抑制紙片法檢測(cè)牛乳中抗生素殘留起步較早[3]，而TTC法在國(guó)際上應(yīng)用較少。我國(guó)2008年更新了TTC法檢測(cè)牛乳中抗生素殘留的國(guó)標(biāo)方法，但還沒(méi)有微生物抑制紙片法檢測(cè)牛乳中抗生素殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法[4]。另外，由于高效液相色譜法（HPLC）的色譜條件不確定，也沒(méi)有對(duì)頭孢噻呋殘留的HPLC檢測(cè)方法研究[5-6]。研究采用微生物抑制紙片法、TTC法和HPLC法檢測(cè)牛乳中的頭孢噻呋殘留，比較3種檢測(cè)方法的最低檢出量，探討不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，可為衛(wèi)生安全地食用牛乳奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及原料

藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)牡丹江食品與生物技術(shù)創(chuàng)新研究院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；牛乳，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 試劑及儀器

頭孢噻呋鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度87.5%（批號(hào)K0330406）；乙腈（色譜純）；三氯乙酸（色譜純），購(gòu)自Sigma公司。檢測(cè)培養(yǎng)基：AM1瓊脂（抗生素測(cè)定1號(hào)瓊脂）；純化及傳代培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆瓊脂）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；氯化三苯基四氮唑（TTC），購(gòu)自上海生工生物工程公司。TGL-16B型離心機(jī)；510 Pump型液相色譜儀；JD100-3B型電子分析天平；RP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 TTC法測(cè)定頭孢噻呋殘留

分別在牛乳中添加質(zhì)量濃度為1.000，0.500，0.100，0.050，0.010，0.005 mg/L頭孢噻呋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻后作為抗生素殘留乳樣。頭孢噻呋殘留的測(cè)定，參照GB/T 4789.27—2008進(jìn)行。

1.4 微生物抑制紙片法測(cè)定頭孢噻呋殘留

1.4.1 菌懸液的制備

將藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)活，接種皿平板分離出單個(gè)菌落，挑取單個(gè)菌落接種TSA斜面，于37℃條件下培養(yǎng)18~ 24 h。取斜面菌苔制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?.5 m L注入滅菌平皿內(nèi)，加入10mL溶化后冷卻至50℃左右的AM1瓊脂，將瓊脂與菌懸液充分混勻后保持水平使其凝固，置于42℃溫箱中烘干20 min。分別在牛乳中添加不同質(zhì)量濃度的頭孢噻呋工作液（0.500，0.100，0.050，0.010，0.005mg/L），混勻后作為測(cè)定試樣。

1.4.2 測(cè)定

取制備好的檢定用平板，在平板底部做好標(biāo)記，把濾紙片以適當(dāng)間隔置于平板上，每個(gè)平板放置3個(gè)濾紙片，用鑷子輕壓使其固定，在每片濾紙上加100μL測(cè)定試樣液，同時(shí)作陰性、陽(yáng)性對(duì)照，靜置10 min后，置于37℃條件下培養(yǎng)18 h后觀察，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。每份試樣做2個(gè)平板的平行試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照采用頭孢噻呋的工作應(yīng)用液，無(wú)添加頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)液的牛乳作為陰性對(duì)照。

1.5 HPLC法測(cè)定頭孢噻呋殘留

1.5.1 樣品處理

用吸管準(zhǔn)確吸取0.5mL牛乳樣品于1.5mL微型離心管中，用超聲波清洗器超聲處理20min，使其均勻，加入0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氟乙酸，搖勻后放置20 min，放入離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，上層液體通過(guò)0.45μm水系微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，供高效液相色譜分析。

1.5.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（Waterssysmmetry），250mm× 4.6mm（I.D.），粒徑5μm；流動(dòng)相：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%三氟乙酸∶乙腈（70∶30）；檢驗(yàn)波長(zhǎng)290 nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫40℃。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線(xiàn)制備

頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于100 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的三氟乙酸定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別在牛乳中添加不同量的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻后作為測(cè)定試樣，待測(cè)乳樣的質(zhì)量濃度分別為1.00，0.50，0.10，0.05，0.01 mg/L，然后分別過(guò)0.45μm水系醋酸纖維微孔濾膜，收集濾液供高效液相色譜分析。以保留時(shí)間定性、峰面積定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，并確定最低檢出量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC法測(cè)定結(jié)果

TTC法測(cè)定樣品中頭孢噻呋殘留結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TTC法測(cè)定樣品中頭孢噻呋殘留結(jié)果

加入TTC指示劑的乳樣準(zhǔn)確培養(yǎng)30 min后，第1次觀察結(jié)果如不顯色者，再繼續(xù)培養(yǎng)30 min，作為第2次觀察，判斷其顯色狀態(tài)。檢樣呈牛乳的本色時(shí)為陽(yáng)性，如呈紅色者為陰性。由表1可以看出，TTC法的頭孢噻呋最低檢出量為0.100mg/L。該法簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需特殊設(shè)備，3~4 h可見(jiàn)報(bào)告，適合牧場(chǎng)、乳品廠(chǎng)及食品衛(wèi)生檢測(cè)部門(mén)采用。

2.2 微生物抑制紙片法測(cè)定結(jié)果

如果檢定平板中陽(yáng)性對(duì)照的抑菌圈直徑≥13mm，陰性對(duì)照無(wú)抑菌圈，可認(rèn)為檢出頭孢噻呋殘留。用游標(biāo)卡尺測(cè)量測(cè)定試樣的抑菌圈直徑大小，計(jì)算平均值。

微生物抑制紙片法測(cè)定頭孢噻呋殘留結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微生物抑制紙片法測(cè)定頭孢噻呋殘留結(jié)果

微生物抑制紙片法的最低檢出量為0.01 mg/L，試驗(yàn)所選用的3種測(cè)定用菌株對(duì)奶牛飼養(yǎng)業(yè)常使用的抗生素均有良好的敏感性。由表2可以看出，藤黃微球菌對(duì)頭孢噻呋敏感，其他2種菌不敏感。

試驗(yàn)測(cè)定用平板瓊脂的厚度直接影響抑菌圈直徑的大小，瓊脂厚的抑菌圈小，瓊脂薄的抑菌圈大。9 cm的平板加注8 mL瓊脂較合適，瓊脂太薄，經(jīng)37℃培養(yǎng)容易引起平板干燥裂開(kāi)，影響結(jié)果判斷。試驗(yàn)測(cè)定用平板檢定用菌的濃度和加入量直接影響抑菌圈大小與清晰度，抑菌圈直徑大小隨著測(cè)定菌液濃度的增加而減小，但菌液濃度太小會(huì)導(dǎo)致抑菌圈模糊不清。選擇0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木簼舛龋總€(gè)平板上加入0.5mL的菌液在抑菌圈大小與清晰度方面取得平行，效果最佳。采用微生物抑制紙片法檢測(cè)牛乳中的抗生素，具有快速靈敏、儀器要求簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，18~24 h即可得出結(jié)果，適應(yīng)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和基層實(shí)驗(yàn)室使用。

2.3 HPLC法測(cè)定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖1，HPLC法測(cè)定頭孢噻呋殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖1 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜分析結(jié)果

圖2 HPLC法測(cè)定頭孢噻呋殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖1可知，頭孢噻呋的保留時(shí)間為3.127 min，根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，測(cè)定乳樣中頭孢噻呋的質(zhì)量濃度，結(jié)果以峰面積歸一法計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。所得線(xiàn)性回歸方程為Y= 753.02X+4.795 8，相關(guān)系數(shù)為0.997 9，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.2 頭孢噻呋殘留的最低檢出限

將頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行系列稀釋?zhuān)?dāng)上樣質(zhì)量濃度為0.005 mg/L時(shí)上樣20μL，信號(hào)限與噪音限之比為2∶1~3∶1，因此確定最低檢出量為0.10μg/L。

3 結(jié)論

比較不同檢測(cè)方法測(cè)定頭孢噻呋殘留的最低檢出限，高效液相色譜法檢出量最低，為0.10μg/L，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、色譜峰分離優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，但成本偏高，比較適合于實(shí)驗(yàn)室操作研究。其次是微生物抑制紙片法，最低檢出限為0.01 mg/L，此法易操作，最低檢出量較低，且成本不高，但培養(yǎng)菌種時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不適合企業(yè)快速測(cè)定抗生素殘留。TTC法的最低檢出限最高，為0.10 mg/L，但TTC法簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需特殊設(shè)備，3~4 h可見(jiàn)報(bào)告，比較適合牧場(chǎng)、乳品廠(chǎng)及食品衛(wèi)生檢測(cè)部門(mén)采用。

[1]Marchetti M，Schwaiger I，Schmid E.Determination of benzylpenicillin，oxacillin，cloxacillin，and dicloxacillin in cows'milk by ion-pair high-performance liquid chromatography after precolumn derivatization[J].Fresenius'Journal of AnalyticalChemistry，2001（1）：64-67.

[2]Linage B，Gonzalo C，Carriedo JA，et al.Performance of blue-yellow screening test for antim icrobial detection in ovinemilk[J].Journal of Dairy Science，2007，90（12）：5 374-5 379.

[3]Wang J，Leung D.Analyses ofmacrolide antibiotic residues in eggs，rawmilk，and honey using both ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flightmass spectrometry and high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21（19）：3 213-3 222.

[4]Townsend D E，Irving R L，Naqui A.Comparison of the SimPlate coliform and Escherichia coli test with Petrifilm, three-tube MPN，and VRBA+MUGmethods for enumerating coliforms and E.coli in food[J].Journal of Food Protection，1998，61（4）：444-449.

[5]Gunasekera T S，Veal D A，Attfield P V.Potential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milk[J].International Journal of Food Microbiology，2003，85（3）：269-279.

[6]Gunasekera TS，Attfield PV，Veal D A.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66（3）：1 228-1 232.◇

Research on the Detection Method of Ceftiofur Residue in Milk

SUN Huiye1，*SUN Daqing2，WEIYulong2
（1.Vocational School of Jixian County，Shuangyashan，Heilongjiang 155900，China；2.Mudanjiang Food and Biotechnology Innovation Institute，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Mudanjiang，Heilongjiang 157000，China）

The ceftiofur residues inmilk is determined by TTC，microbial inhibition and HLPCmethods.Advantages and disadvantagesof thesemethods are compared.The resultsshow theminimum detection limitof TTCmethod is 0.10mg/L.Theminimum detection limitofmicrobial inhibitionmethod is 0.01mg/L.Theminimum detection limitof HPLCmethod is 0.10μg/L.By comparing distrinctmethods，the TTCmethod is simple，fast and does not require special equipment and is particularly suitable for use in farms and grass roots，while HPLC is accurate，sensitive and suitable for laboratory.

milk；ceftiofur；microbial inhibitionmethod；high performance liquid chromatography

S859.84

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.016

1671-9646（2017）04a-0048-03

2017-03-23

孫慧葉（1980—），女，本科，中學(xué)一級(jí)教師，研究方向?yàn)槭称方逃c研究。

*通訊作者：孫大慶（1979—），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。