王祥云金銀銀汪志威張 倩王新全閔順根

（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100093；2省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021）

氣相色譜法測定蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯的殘留

王祥云1，2金銀銀2汪志威2張 倩2王新全2閔順根1

（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100093；2省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021）

氟胺氰菊酯屬于合成除蟲菊酯，是國內(nèi)蜂業(yè)生產(chǎn)中使用最廣泛的殺螨劑，在蜂蜜和蜂王漿等蜂產(chǎn)品中潛在殘留風(fēng)險。本文建立了蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留測定方法。方法以正己烷+丙酮混合溶液提取蜂蜜和蜂王漿樣品中的氟胺氰菊酯殘留，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取柱凈化，以氣相色譜—電子捕獲檢測器檢測，外標(biāo)法定量。試驗結(jié)果顯示，在5～100 μg/kg添加水平下，方法回收率在90.6～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，滿足殘留分析方法的要求；蜂蜜和蜂王漿中的方法定量限分別為5 μg/kg和10 μg/kg，滿足國內(nèi)外殘留限量的要求。

蜂蜜；蜂王漿；氟胺氰菊酯；氣相色譜帶電子捕獲檢測器

1 前言

蜂螨是蜂業(yè)生產(chǎn)中的頭號病蟲害，蜂農(nóng)每年需進(jìn)行1~3次藥物防治以確保蜂群的正常發(fā)展[1]。對于蜂螨的防治，世界各國科學(xué)家和從業(yè)者嘗試了各種措施，但效果最顯著、起效最快的仍為化學(xué)合成殺螨劑。目前蜂農(nóng)使用化學(xué)殺螨劑主要為氟胺氰菊酯，氟胺氰菊酯對蜜蜂大蜂螨等寄生螨具有極好的防效，且對蜜蜂的毒性最低，因而在世界范圍內(nèi)成為了應(yīng)用最廣泛的蜂業(yè)殺螨劑[2]。

我國自20世紀(jì)90年代推廣使用新型氟胺氰菊酯殺螨制劑——“螨撲”[3]以來，蜂螨至今已對其產(chǎn)生了較大的抗藥性，迫使蜂農(nóng)在使用時增加劑量和頻率，導(dǎo)致蜂蜜和蜂王漿產(chǎn)品中的氟胺氰菊酯殘留風(fēng)險越來越高[2]。此外，近年來氟胺氰菊酯被發(fā)現(xiàn)具有一定的發(fā)育和生殖毒性，對消費者潛在一定的健康風(fēng)險，歐盟更是將其列為內(nèi)分泌干擾物[4]。為此，國內(nèi)外各主管部門為確保消費者的蜂產(chǎn)品食用安全，紛紛建立了蜂蜜和蜂王漿中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，日本[5]、歐盟[6]分別規(guī)定了蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留限量為0.05 mg/ kg；我國規(guī)定了蜂蜜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg[7]，蜂王漿中尚無明確規(guī)定；美國僅規(guī)定了蜂蜜中的氟胺氰菊酯殘留限量為0.02 mg/kg[8]。

目前，蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量的儀器檢測方法較多[9]，包括氣相色譜法[10-15]、氣相色譜質(zhì)譜法[16]、液相色譜法[17-19]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[20-21]等。然而，針對靈敏度最高、儀器保有量最大的氣相色譜電子捕獲檢測器的相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)方法已稍顯陳舊，個別方法表現(xiàn)出溶劑用量大、使用含氯試劑等不足，本文擬建立基于氣相色譜電子捕獲檢測器，能同時滿足蜂蜜、蜂王漿乃至兩者混合物中的氟胺氰菊酯殘留量檢測的分析方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

GC 2010 Plus氣相色譜儀，配備電子捕獲檢測器和自動進(jìn)樣器；渦旋儀；離心機(jī)；氮吹儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；固相萃取裝置。弗羅里硅土柱（1 g，6 ml，天津博納艾杰爾科技有限公司）。氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所），正己烷、丙酮均為分析純，購自華東醫(yī)藥有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 試樣提取

準(zhǔn)確稱取2 g蜂王漿或5 g蜂蜜（精確至0.01 g）至50 ml離心管中，加入10 ml水并渦旋10 s以溶解樣品，靜置1 min，加入20 ml正己烷-丙酮（1+1，V/V），渦旋震蕩提取1 min，7000 r/min離心3 min，取上清液于100 ml雞心瓶中，殘渣再加入20 ml正己烷-丙酮（1+1，V/V）渦旋提取一次，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于300 Mpa、37℃濃縮至近干，氮氣吹干，待凈化。

2.2.2 試樣凈化

以5 ml正己烷進(jìn)行淋洗活化弗羅里硅土柱，以9 ml正己烷分3次超聲雞心瓶，并依次轉(zhuǎn)移至萃取小柱上，棄去上述流出液，最后以10 ml正己烷+丙酮（95+ 5，V/V）洗脫目標(biāo)化合物，收集于10 ml刻度管中，37℃水浴下氮吹干，以1 ml正己烷渦旋超聲定容后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，以氣相色譜質(zhì)譜電子捕獲檢測器檢測，外標(biāo)法定量。

2.2.3 儀器條件

色譜柱：VF-1MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)石英毛細(xì)管柱；載氣：氮氣，純度≥99.999%；流速為1.0 ml/ min；進(jìn)樣口溫度：280℃；檢測溫度：300℃；柱溫：溫度80℃，保持1min，30℃/min升至200℃，保持1min，隨后以10℃/min升至280℃保持6 min；進(jìn)樣量：1μl；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 min后打開分流閥。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測儀器的確定

關(guān)于氟胺氰菊酯的檢測，現(xiàn)有文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)中所使用檢測儀器主要包括氣相色譜帶電子捕獲檢測器（GCECD）、氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）、液相色譜帶紫外檢測器（LC-UVD）以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）等。

為評價各儀器對氟胺氰菊酯的檢測效果，試驗中分別配置了氟胺氰菊酯的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中GCECD和GC-MS采用正己烷稀釋，LC-UVD和LC-MS/ MS采用甲醇水溶液稀釋。試驗結(jié)果見表1。

表1 氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在各儀器上的響應(yīng)情況

表1中的結(jié)果表明，對于氟胺氰菊酯的測定，GCECD和LC-MS/MS具有更佳的靈敏度，線性范圍也足以滿足檢測工作的需求。但考慮到GC-ECD在各類實驗室配置比例更高，選其作為氟胺氰菊酯的檢測儀器，有助于提高方法的適用性。因此，最終本方法采用GCECD作為檢測儀器。

3.2 提取溶劑的選擇與優(yōu)化

綜合《SN/T 2575-2010進(jìn)出口蜂王漿中多種菊酯類農(nóng)藥殘留量檢測方法》[14]、《農(nóng)業(yè)部781號公告-9-2006蜂蜜中氟胺氰菊酯殘留量的測定氣相色譜法》[10]和《SN/T 0213.5-2002出口蜂蜜中氟胺氰菊酯殘留量檢驗方法液相色譜法》[17]等標(biāo)準(zhǔn)方法及《氣相色譜法測定蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量》[11]、《蜂王漿中氟胺氰菊酯與氟氯苯氰菊酯殘留的提取凈化及超高效液相色譜測定方法研究》[19]、《氣相色譜法同時檢測蜂蜜中溴螨酯、蠅毒磷、氟胺氰菊酯和氟氯苯氰菊酯殘留》[13]等相關(guān)文獻(xiàn)方法的結(jié)果表明，正己烷+丙酮（1+1，V/V）、正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）和乙腈是蜂蜜或蜂王漿中氟胺氰菊酯提取的常用溶劑。

試驗中，首先進(jìn)行了提取液溶劑用量試驗。在蜂蜜和蜂王漿試樣中添加適量的氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得添加水平為50 μg/kg的待測樣品。隨后以3×20 ml提取液進(jìn)行三階段提取，并各自進(jìn)行后續(xù)的分析過程。試驗結(jié)果表明：三種提取液的結(jié)果基本一致。大部分氟胺氰菊酯被第一階段20 ml提取液有效提取，第二階段20 ml可將剩余氟胺氰菊酯完全提取，第三階段20 ml提取液中無氟胺氰菊酯殘留檢出。即2×20 ml提取液可將試樣中的可提取氟胺氰菊酯殘留完全提取。試驗隨即開展了上述溶劑對蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯提取效率的研究，試驗結(jié)果詳見表2。

表2 蜂蜜、蜂王漿中氟胺氰菊酯以不同提取液提取的回收率和變異系數(shù)（n=6）

結(jié)果顯示：對于蜂蜜而言，三種提取液均可得到良好的提取效果；對于蜂王漿而言，僅有正己烷+丙酮（1+ 1，V/V）能高效、穩(wěn)定的提取蜂王漿中的氟胺氰菊酯，正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）和乙腈的提取效率均偏低，且乙腈作為提取液時發(fā)現(xiàn)提取效率以及穩(wěn)定性都較差。其中蜂王漿試驗中正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）與乙腈的提取回收率偏低，可能源于提取過程中形成的膠狀體，剩余的氟胺氰菊酯殘留被膠狀體所包覆而無法完全提取。

3.3 凈化方式的選擇和優(yōu)化

根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)方法，選用HLB（500 mg,6 ml,Waters）和弗羅里硅土（1 g,6 ml,Agela）固相萃取柱作為凈化萃取柱，并重點考察淋洗液種類及體積對樣品回收率及凈化效果的影響。

3.3.1 淋洗曲線

在經(jīng)預(yù)淋洗的小柱上加入1 ml正己烷稀釋的氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以下列凈化方式開展淋洗曲線試驗。

凈化方式1：HLB柱，以正己烷+二氯甲烷（1+1，V/ V）洗脫；凈化方式2：弗羅里硅土柱，以正己烷+乙醚（9+1，V/V）洗脫；凈化方式3：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（9+1，V/V）洗脫；凈化方式4：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（95+5，V/V）洗脫；凈化方式5：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（98+2，V/V）洗脫。

結(jié)果顯示：凈化方式1～5分別需要2 ml、24 ml、10 ml、10 ml和20 ml洗脫液，考慮節(jié)約溶劑及實驗室時間的考慮，排除了凈化方式2和5，后續(xù)在凈化方式1、3和4的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法優(yōu)化。

3.3.2 最佳比例洗脫液的確定

分別以凈化方式1、3和4做回收實驗，添加濃度為50 μg/kg，以考察其回收率，確定最佳比例洗脫液（結(jié)果見表3）。

表3 不同凈化方式的回收情況(n=3)

表4 方法回收率和精密度

根據(jù)表3的結(jié)果顯示，三種凈化方式的回收率和變異系數(shù)均在《GBT 27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[22]附錄F要求范圍內(nèi)，即均可滿足本法的的需求。考慮到凈化方式4的變異系數(shù)以及譜圖相對更為干凈，最終選擇正己烷-丙酮（95+5，V/V）作為洗脫液，洗脫體積為10 ml。

3.4 方法的線性范圍和靈敏度

以正己烷分別配置1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/ L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液，經(jīng)氣相色譜電子捕獲檢測器檢測，結(jié)果表明，氟胺氰菊酯的儀器響應(yīng)在10.0~500 μg/L范圍內(nèi)呈線性，回歸方程為y=3291x-10612，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999。

實驗通過在樣品中添加系列濃度并進(jìn)行回收測定的方式確定方法的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。結(jié)果表明，在實驗條件下，本方法檢出限分別為蜂蜜中2 μg/kg、蜂王漿中4 μg/kg，方法定量限分別為蜂蜜中5 μg/kg、蜂王漿中10 μg/kg，結(jié)果見表4。

考慮到國內(nèi)外蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯的最大殘留限量分別為20~50 μg/kg和50 μg/kg，因此本方法的定量限足以滿足蜂蜜和蜂王漿在我國日常監(jiān)管和國內(nèi)外貿(mào)易中的需求。

3.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

本方法以添加回收的方式考察了方法的準(zhǔn)確度和精密度。在空白樣品稱取后，加入0.1 ml相應(yīng)濃度的氟胺氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋1min混勻，靜置半小時，使標(biāo)準(zhǔn)溶液被樣品充分吸收，然后按本方法進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果表明，蜂蜜的方法回收率90.6~95.7%，蜂王漿的方法回收率在95.9~110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到殘留分析方法的要求，代表性圖譜見圖1。

圖1 蜂蜜和蜂王漿的空白和添加圖譜

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[3]農(nóng)業(yè)科技通訊編輯部.新型高效殺蜂螨制劑-螨撲的試制與推廣[R].農(nóng)業(yè)科技通訊.1997:33.

[4]歐盟委員會官網(wǎng).內(nèi)分泌干擾物研究優(yōu)先列表.[查詢時間2016-09-17].

[5]日本肯定列表.農(nóng)產(chǎn)品中氟胺氰菊酯限量 [OL].[查詢時間2016-09-17].

[6]歐盟食品安全委員會農(nóng)藥殘留數(shù)據(jù)庫 [OL].[查詢時間2016-09-17].

[7]農(nóng)業(yè)部235號公告.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

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The determination of Tau-fluvalinate residue in Honey and Royal jelly by Gas Chromatography

Wang Xiangyun1，2,Jin Yinyin2,Wang Zhiwei2,Zhang Qian2,Wang Xinquan2,Min Shungen1
(1 College of Science,China Agricultural University,Beijing 100094;2 State Key Lab Breeding Base for Zhejiang Sustainable Plant Pest Control;MOA Key Lab for Pesticide Residue Detection;Institute of Quality and Standard for A－gro-products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences;Hangzhou 310021)

Tau-fluvalinate,an synthesized pyrethrin,was the most popular miticide in bee industry and then caused the residue risk in the honey and royal jelly.A method was developed to determine the residue of Tau╞fluvalinate in honey and royal jelly.The residue was extracted by n-hexane and acetone mixture,cleaned by a florisil column, detected by a gas chromatography with electron capture detector and calculated with external standards.At fortification levels 5~100 μg/kg,the recoveries ranged from 90.6~110%and the relative standard deviation was less than 10%.The quantitation limits of method were 5 μg/kg for honey and 10 μg/kg for royal jelly,which were sensitive enough compared to the MRLs set by governments around the world.

honey;royal jelly;tau-fluvalinate;gas chromatography with electron capture detector

浙江省自然科學(xué)基金（LQ14B070004）

王祥云（1983-），副研究員，博士研究生，從事農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥等污染物研究。

閔順耕（1963-），教授，博導(dǎo)，從事農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與農(nóng)藥殘留快速分析技術(shù)，minsg@263.net。