趙傳怡 張慶樂 許福生 張凌霄 王福剛 王浩

（泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安 271016）

蜂膠黃酮
——鋁鋯復(fù)合氧化物的制備和緩釋性能研究

趙傳怡 張慶樂 許福生 張凌霄 王福剛 王浩

（泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安 271016）

利用鋁鋯復(fù)合氧化物作為新型藥物緩釋材料，對(duì)蜂膠黃酮進(jìn)行負(fù)載和緩釋，為提高其生物利用度提供科學(xué)依據(jù)。方法:利用植物提取液為軟模板合成鋁鋯復(fù)合氧化物，通過單一因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)該材料的制備條件對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響，并利用體外試驗(yàn)分析了蜂膠黃酮的緩釋效果。結(jié)果:以冬青提取液作為溶劑、三氯化鋁和氯氧化鋯的摩爾比為8∶1，添加0.08 g納米海泡石和400 mg/L環(huán)糊精時(shí)制備的鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的最大負(fù)載率為83.41%。蜂膠黃酮—鋁鋯復(fù)合氧化物在模擬胃液和腸液中最大釋放時(shí)間為480 min。結(jié)論:鋁鋯復(fù)合氧化物適宜作為蜂膠黃酮的緩釋載體。

鋁鋯復(fù)合氧化物；蜂膠黃酮；冬青提取液；緩釋

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝物質(zhì)，廣泛分布于植物的根、表皮、葉片和果實(shí)中，其在植物體內(nèi)的含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[1]。許多研究表明，黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血脂、增強(qiáng)免疫力等多種藥理活性，在預(yù)防阿爾默茨海默病和心血管疾病等方面具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值[2-4]。與大多數(shù)天然植物相比，蜂膠中所含有的黃酮種類豐富且含量較高，其提取技術(shù)和藥物制劑劑型的研究引起了中外學(xué)者的廣泛關(guān)注。乙醇提取法是目前蜂膠黃酮和其他植物黃酮提取中應(yīng)用最為廣泛的提取技術(shù)[5]，然而由于蜂膠黃酮難溶于水，生物利用度低，其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用受到很大限制[6]。開發(fā)黃酮制劑的新劑型，提高其生物利用度成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

載藥納米粒是一種藥物控釋和緩釋的新劑型，常用的載藥材料包括生物可降解聚合物如聚乳酸、聚己內(nèi)酯等疏水性聚合物[7，8]、殼聚糖、海藻酸鈉等親水性聚合物[9，10]和固體脂質(zhì)如飽和脂肪酸甘油酰、卵磷脂、甘油三酯等[11，12]。層狀雙金屬氧化物因其具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，層間存在可交換的陰離子，藥物分子可插層于層狀雙金屬氧化物的層間而形成藥物/層狀雙金屬氧化物雜化物[13，14]，從而使其成為一種極具潛力的藥物緩釋載體材料。許多研究表明，制備方法和條件對(duì)層狀雙金屬氧化物的形貌結(jié)構(gòu)具有顯著影響[15，16]，從而影響其藥物負(fù)載能力。模板法是目前合成層狀雙金屬氧化物的最常見方法，利用植物提取液作為溶劑和分散劑，通過改變制備條件，可對(duì)層狀雙金屬氧化物的顆粒大小和藥物負(fù)載能力進(jìn)行有效調(diào)控。

本文采用冬青提取液為軟模板合成鋁鋯復(fù)合氧化物，利用其作為新型緩釋材料，探討了其制備條件對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載量的影響和緩釋效果。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)儀器

主要儀器：KQ-100型超聲波清洗儀（北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；TDL-5A型臺(tái)式離心機(jī)（金壇市宏華儀器廠）；HJ-6型六聯(lián)磁力攪拌器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；HY-3型恒溫振蕩器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；752S紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1.蜂膠黃酮的制備

采用付英娟等人[17]的方法對(duì)蜂膠總黃酮進(jìn)行提?。簩?.2 g蜂膠和一定量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液加入到錐形瓶中，置于超聲波清洗儀中在功率540W下提取20 min，經(jīng)離心分離后，濾渣重復(fù)超聲提取若干次，合并濾液，將濾液置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.2 鋁鋯復(fù)合氧化物的制備

利用植物提取液為軟模板合成鋁鋯復(fù)合氧化物，主要步驟如下：將一定量的三氯化鋁、氯氧化鋯、納米海泡石和環(huán)糊精加入到盛有100 ml植物提取液的燒杯中，將其置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌2h，使溶液混合均勻。然后，利用1.0mol/L的氫氧化鈉溶液對(duì)其進(jìn)行逐滴滴定，直至溶液的pH為9.5，繼續(xù)攪拌2 h后，將混合液置于80℃的烘箱中陳化24 h，過濾后，將濾渣于105℃干燥24 h，得到鋁鋯復(fù)合氧化物。通過改變金屬鹽種類、鋁鋯摩爾比、納米海泡石和環(huán)糊精加入量等反應(yīng)條件制備系列鋁鋯復(fù)合氧化物。

2.3 蜂膠黃酮負(fù)載方法

將0.1g的鋁鋯復(fù)合氧化物加入到盛有100 ml濃度為85mg/L蜂膠黃酮的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進(jìn)行震蕩反應(yīng)，待反應(yīng)達(dá)到平衡后，過濾。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉顯色體系中進(jìn)行顯色反應(yīng)，利用紫外可見分光光度計(jì)在510nm處測(cè)定濾液的吸光值，利用下式（1）計(jì)算蜂膠黃酮負(fù)載率：

采用ANSYS三維有限元計(jì)算軟件進(jìn)行模擬計(jì)算分析。根據(jù)實(shí)例工程的特性及相關(guān)參數(shù)，網(wǎng)格選擇矩形網(wǎng)格，網(wǎng)格間距設(shè)置為5～20m，整個(gè)模型共有12856個(gè)節(jié)點(diǎn)與8266個(gè)網(wǎng)格（圖3）。

式中：R為蜂膠黃酮負(fù)載率；C0為蜂膠黃酮初始濃度；Ce為蜂膠黃酮平衡濃度。

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化鋁鋯復(fù)合氧化物的制備條件

依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取鋁鋯摩爾比、海泡石投加量、環(huán)糊精濃度3個(gè)影響因素進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，對(duì)鋁鋯復(fù)合氧化物的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，以蜂膠黃酮負(fù)載率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最優(yōu)制備條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

2.5 蜂膠黃酮釋放量的測(cè)定

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

首先，配制pH值為4.8的磷酸一檸檬酸緩沖溶液和pH值為7.2的磷酸緩沖溶液作為人工胃液和腸液。然后，將0.3g蜂膠黃酮/鋁鋯復(fù)合氧化物雜化材料加入到100ml的模擬胃液和腸液中，在37℃、100 r/min下進(jìn)行恒溫震蕩，按照設(shè)定的時(shí)間間隔進(jìn)行取樣,經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后,利用紫外——可見分光光度計(jì)在510 nm下測(cè)定其吸光度,計(jì)算蜂膠黃酮釋放量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 制備條件對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

3.1.1 不同金屬氧化物對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

將0.001 mol的氯化鋁、氯氧化鋯、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鋅、氯化錫、硝酸鈰分別加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，利用類似合成方法，得到氧化鋁、氧化鋯、氧化鎂、氧化鐵、氧化鋅、氧化錫、氧化鈰七種材料。由圖1可知，氧化錫對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率最低為41.2%，氧化鐵、氧化鋅、氧化鎂和氧化鈰對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率為50%左右，而氧化鋁和氧化鋯對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率較高，分別為57.6%和60.6%。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中通過調(diào)整鋁鋯摩爾比來評(píng)價(jià)鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響。

圖1 不同金屬氧化物對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

3.1.2 鋁鋯摩爾比對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

圖2 鋁鋯摩爾比對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

將總摩爾質(zhì)量為0.001mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比分別為1∶1、1∶4、1∶8、4∶1、8∶1）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，合成鋁鋯復(fù)合氧化物。由圖2可知，隨著鋁鋯摩爾比的增加，鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，當(dāng)鋁鋯摩爾比為4∶1時(shí)，該復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率達(dá)到最大值70%，繼續(xù)增加鋁鋯摩爾比，蜂膠負(fù)載率基本趨于穩(wěn)定。因此，選擇鋁鋯摩爾比為4∶1時(shí)制備該復(fù)合氧化物效果較好。

3.1.3 納米海泡石投加量對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

圖3 海泡石含量對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

將總摩爾質(zhì)量為0.001mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比為4∶1）和不同質(zhì)量的納米海泡石（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，采用類似方法合成鋁鋯復(fù)合氧化物。由圖3可知，當(dāng)納米海泡石的投加量從0.02 g增加到0.08 g時(shí)，鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率從48.8%迅速增加到68.8%。超過0.08 g后，繼續(xù)增加納米海泡石的用量，鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率基本穩(wěn)定。因此，選用0.08 g的納米海泡石進(jìn)行鋁鋯復(fù)合氧化物的制備為宜。

3.1.4 環(huán)糊精濃度對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

圖4 環(huán)糊精含量對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載率的影響

將總摩爾質(zhì)量為0.001 mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比為4∶1）、0.08 g的納米海泡石和不同質(zhì)量濃度的環(huán)糊精（0、100、200、400、600、800、1000 mg/L）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，采用類似方法合成鋁鋯復(fù)合氧化物。由圖4可知，當(dāng)環(huán)糊精濃度從0 mg/L增加到200 mg/L時(shí)，隨著環(huán)糊精濃度的增加，蜂膠黃酮的負(fù)載率從68.8%增加到80.6%;而當(dāng)環(huán)糊精濃度超過200mg/L時(shí)，蜂膠黃酮的負(fù)載率增速較為緩慢，基本穩(wěn)定在82%左右。因此，選取環(huán)糊精濃度為200mg/L進(jìn)行鋁鋯復(fù)合氧化物的制備。

3.2 響應(yīng)面分析

使用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)鋁鋯摩爾比、海泡石投加量、環(huán)糊精濃度3個(gè)影響因素設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，相應(yīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 響應(yīng)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

數(shù)據(jù)分析和顯著性檢驗(yàn)見表3。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)二次方程式的數(shù)學(xué)模型擬合后，得到鋁鋯復(fù)合氧化物的最佳制備條件的數(shù)學(xué)模型為：Y=+ 82.57-0.42X1-1.16X2+6.43X3-5.26X2X3-5.94X12-7.75 X22+11.02X32。由表3中的P＜0.01可以看出，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，即這種試驗(yàn)方法是可靠的。從各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)來看，X3是影響鋁鋯復(fù)合氧化物制備的關(guān)鍵因子。X1和X2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不太明顯。另外，方程的失擬項(xiàng)F=93.41，顯著，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)?；貧w模型預(yù)測(cè)的最佳去除率的工藝條件是鋁鋯摩爾比為8∶1、海泡石投加量為0.08 g、環(huán)糊精濃度為400 mg/L，此條件下制備的鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的最大負(fù)載率為83.41%。

3.3 蜂膠黃酮的釋放率的測(cè)定

由圖5可知，經(jīng)鋁鋯復(fù)合氧化物負(fù)載后，蜂膠黃酮在pH4.8（模擬胃液）和pH 7.2（模擬腸液）下的釋放率均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，且在模擬胃液下的釋放效果更佳。整個(gè)釋放過程可分為三段：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于120 min時(shí)，蜂膠黃酮在模擬胃液和腸液下的釋放率增幅較大；在120～480 min時(shí)，蜂膠黃酮在模擬胃液和腸液下的釋放率增幅較為緩慢，逐漸趨于穩(wěn)定。超過480 min后，蜂膠黃酮釋放率基本穩(wěn)定。因此，該復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的最大緩釋時(shí)間為480 min，在模擬胃液和腸液的最大釋放率分別為82.3%和75.7%。

表3 回歸方程的方差分析表

圖5 蜂膠黃酮在pH為4.8和pH為7.2下的釋放率曲線

4 結(jié)論

利用冬青提取液為軟模板合成的鋁鋯復(fù)合氧化物作為新型緩釋材料，對(duì)蜂膠黃酮進(jìn)行負(fù)載和緩釋，試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）制備條件對(duì)蜂膠黃酮負(fù)載量有顯著影響，當(dāng)向100ml冬青提取液中添加總摩爾質(zhì)量為0.001 mol的氯化鋁和氯氧化鋯（摩爾比為8∶1）、0.08 g的納米海泡石、400 mg/L的環(huán)糊精時(shí)制備的鋁鋯復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮的負(fù)載率達(dá)到最大值83.41%。（2）在模擬胃液和腸液下,該復(fù)合氧化物對(duì)蜂膠黃酮具有較好的緩釋效果，最大釋放時(shí)間為480 min。

[1]邵芳芳,尹衛(wèi)平,梁菊.重要的植物多酚及抗氧化性能的研究概況［J］.西北藥學(xué)雜志,2012,225(1):66-68.

[2]曹秦,吳輝,張蓓蓓,等.黃酮類化合物在防治神經(jīng)退行性疾病中作用的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2015,29(3): 457-463.

[3]李冬生,陳朝銀,趙聲蘭,等.黃酮類化合物改善記憶的機(jī)制研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(10):360-365.

[4]郭雪微,盧梃,王雪里紅.天然黃酮類化合物在心腦血管疾病中應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2006,26(4):1001-1003

[5]李帥,趙巖巖,陳曉平.響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2012,33(18):127-132

[6]程智剛.蜂膠提取活性黃酮及酯萜類新工藝和其納米制劑—蜂膠總黃酮硬脂酸固態(tài)脂質(zhì)納米粒制備及藥理學(xué)研究[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2005,1-116

[7]Wei Zhang,Jing gao,Quangang Zhu,et al.Penetration and diatribution of PLGA nanoparticles in the human skin treated with microneedles[J].International Journal of Pharmaceuties,2010,402(1-2): 205-212

[8]Wean Sin Cheow,Kunn Hadinoto.Enhancing encapsulation efficiency of highly water-soluble antibiotic in poly(lactic-co-glycolic acid)nanoparticles:Modifications of standard nanoparticle preparation methods[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2010,370(1-3):79-86

[9]程浩南.羧甲基殼聚糖在藥物緩釋和組織工程學(xué)中的應(yīng)用新進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào),2015,21:137-144

[10]馮志云,吳敏,朱昌平,等.聚乙二醇共價(jià)交聯(lián)海藻酸鈉凝膠制備及其藥物緩釋性能 [J].材料科學(xué)與工程學(xué)報(bào)，2015,33（3）：368-371

[11]管清香,朱昆,林天幕,等.可生物降解固體脂質(zhì)納米粒的制備、表征及藥物的體外釋放 [J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2010,31（11）：2298-2302

[12]單良,湯志勇,劉元法,等.蜂膠黃酮萃取物脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化及體外緩釋特性[J].食品科學(xué),2008,29(8):232-237

[13]Rives V,Arco M D,Martín C.Layered double hydroxides as drug carriers and for controlled release of non-steroidal antiin ammatorydrugs(NSAIDs):a review[J].Journal ofControlled Release,2013, 169(1/2):28-39.

[14]Rojas R,Palena MC,Jimenez-Kairuz A F,et al.Modeling drug release from a layered double hydroxide-ibuprofen complex[J].Applied ClayScience,2012,62/63:15-20.

[15］李妍.層狀雙金屬氫氧化物作為藥物載體及其釋放性能研究[J]．濟(jì)南：山東大學(xué)，2008.1-56.

[16]Wang Q,O'Hare D.Recent advances in the synthesis and application of layered double hydroxide (LDH)nanosheets[J].Chemical Reviews,2012,112(7):4124-4155.

[17]付英娟,于智峰,張建新.超聲波提取蜂膠黃酮的條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2007,28（5）：143-146

Preparation of propolis flavonoid/alumina-zirconium oxide composite and controlled-release properties

Zhao Chuanyi,Zhang Qingle,Xu Fusheng,Zhang Lingxiao,Wang Fugang,Wang Hao
(Institute of pharmaceutical,Taishan Medical university,Shan dong Tai'an,271016)

Taking alumina-zirconium composite oxide as a novel material to load propolis flavonoid,providing scientific basis for increasing its bioavailability.Methods:Alumina-zirconium oxide composite was prepared using plant extracts as soft template.Effect of preparation condition of alumina-zirconium oxide composite on propolis flavonoid loading rate was discussed by single factor experiment,and controlled-release properties of propolis flavonoid was analyzed by in vitro test.Results:Using Holly extracts as solvent,when the molar ratio of aluminum chloride and zirconium oxychloride was 8∶1,0.08 g sepiolite and 400mg/L cyclodextrin,the maximum loading ratio of propolis flavonoid on alumina-zirconium composite oxide was got at 83.41%.The maximum release time of propolis flavonoid/alumina-zirconium composite oxide in stimulated gastric juice and intestinal juice was 480 min.Conclusion:Alumina-zirconium oxide composite was suitable for the controlled-release material of propolis flavonoid.

Alumina-zirconium oxide composite;propolis flavonoids;holly extracts；controlled-release

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201510439076)，山東省自然科學(xué)基金（ZR2013HL062）

趙傳怡（1995-），山東萊蕪市人，2013級(jí)藥學(xué)專業(yè)本科學(xué)生

王浩，副教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué),E-mail:tywanghao@163.com。