溫海霞+孟毅++楊永斌+殷立維++張若瞳

[摘要] 目的 觀(guān)察大豆異黃酮主要活性成分金雀異黃素（Genistein）對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19表達(dá)的影響，探討可能的分子機(jī)制。 方法 選擇25～28日齡的雌性大鼠21只，采用孕馬血清促性腺激素（PMSG）皮下注射法建立促卵泡發(fā)育模型，分離顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為0、0.1、1、5、10、100 μmol/L Genistein組、17β-E2（10 nmol/L）組、雌激素受體（ER）-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加Genistein（1和10 μmol/L）組，空白對(duì)照組即0 μmol/L Genistein組。各組細(xì)胞處理48 h后，采用RT-PCR法檢測(cè)CYP19及其上游調(diào)控基因肝受體類(lèi)似物（LRH-1）mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1、5和10 μmol/L Genistein組CYP19和LRH-1mRNA的表達(dá)高于空白對(duì)照組（P < 0.05）；而100 μmol/L Genistein組CYP19和LRH-1 mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與10 μmol/L Genistein相比，Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞30 min后再加入10 μmol/L Genistein組LRH-1 mRNA的表達(dá)明顯下降（P < 0.05），而CYP19 mRNA的表達(dá)則未受Tamoxifen的影響（P > 0.05）。 結(jié)論 1、5和10 μmol/L Genistein可明顯上調(diào)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19和LRH-1 mRNA表達(dá)，但這種促進(jìn)作用可能并非通過(guò)ER-α介導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] 大豆異黃酮；Genistein；卵巢顆粒細(xì)胞；CYP19；LRH-1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（b）-0020-04

Effects of Genistein on the CYP19 expression in rat ovarian granulosa cells

WEN Haixia1 MENG Yi2 YANG Yongbin1 YIN Liwei1 ZHANG Ruotong1

1.Department of Physiology， Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150081， China； 2.Heilongjiang Nursing College， Heilongjiang Province， Harbin 150086， China

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Genistein， which is a major active component for soy isoflavones， on the CYP19 expression in the rat ovarian granulosa cells. Methods 21 female rats， 25-28 day-old， were injected subcutaneously with pregnant mare serum gonadotrophin （PMSG）， ovarian granulosa cells were collected， incubated and treated with Genistein （0， 0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L）， 17β-E2 （10 nmol/L）， and Genistein （1， 10 μmol/L） with estrogen receptor-α （ER-α） blocker Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min. Control group was 0 μmol/L Genistein group. After treated for 48 h， the CYP19 and upstream regulated gene liver receptor homolog-1 （LRH-1） mRNA expression levels were assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA increased for 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）； but the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA for 100 μmol/L Genistein group had no significant difference （P > 0.05）. Compared with 10 μmol/L Genistein group， the expression of LRH-1 mRNA decreased for Genistein （10 μmol/L） with Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min （P < 0.05）， but the expression of CYP19 mRNA was not influenced by Tamoxifen （P > 0.05）. Conclusion 1， 5 and 10 μmol/L Genistein can up-regulation the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CYP19 gene expression is not mediated by ER-α.

[Key words] Soy isoflavones； Genistein； Ovarian granulosa cells； CYP19； LRH-1

大豆異黃酮主要活性成分金雀異黃素（Genistein）具有極強(qiáng)的抗氧化能力[1-2]，因化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素非常相似，能與雌激素受體（ER）結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用，也被稱(chēng)為植物雌激素[3]。研究表明，大豆異黃酮可調(diào)節(jié)雌性?xún)?nèi)分泌活動(dòng)，改善圍絕經(jīng)期綜合征臨床癥狀[4-8]。卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶基因CYP19是雌激素生成的關(guān)鍵酶，之前研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可影響衰老模型大鼠卵巢芳香化酶的表達(dá)[9]，但分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR等方法，觀(guān)察Genistein對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19及上游調(diào)控基因表達(dá)的影響，并利用ER-α阻斷劑進(jìn)一步觀(guān)察Genistein對(duì)CYP19基因表達(dá)的影響與ER-α的關(guān)系，探討大豆異黃酮調(diào)節(jié)卵巢局部?jī)?nèi)分泌功能的分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

25～28日齡未成年健康雌性SD大鼠21只，平均體重（70±10）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：（黑）2013-002。

1.2 主要儀器及試劑

PTC-100型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ. Research）；UV-752紫外分光光計(jì)（英國(guó)Amersham）；GIS凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（上海天能生物）。

Genistein（GEN）、17β-雌二醇（17β-E2）及Tamoxifen（TAM）（美國(guó)Sigma）；Trizol（美國(guó)Invitrogen）；BcaBESTTM RNA PCR Kit（大連Takara）；PCR引物（上海英駿生物合成）。Genistein、17β-E2和Tamoxifen均溶解于70%乙醇，-20℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)大鼠7只，頸部皮下注射血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），建立促卵泡發(fā)育模型。48 h后急性斷髓處死大鼠，仔細(xì)剝離出雙側(cè)卵巢，用小號(hào)針頭反復(fù)刺破卵泡并吹打，使顆粒細(xì)胞充分釋放，200 μm濾網(wǎng)去除組織殘?jiān)箅x心，向細(xì)胞沉淀中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液（含青/鏈霉素），用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105～5×105個(gè)/mL，充分混勻。將細(xì)胞懸液分至6孔板（1 mL/孔），37℃培養(yǎng)箱（5%CO2，95%空氣）孵育。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入Genistein（濃度參考文獻(xiàn)[10-11]）等因素處理。

細(xì)胞共分9組：① 0 μmol/L Genistein組（空白對(duì)照組，A組）；②17β-E2（10 nmol/L）組（B組）；③0.1 μmol/L Genistein組（C組）；④1 μmol/L Genistein組（D組）；⑤5 μmol/L Genistein組（E組）；⑥10 μmol/L Genistein組（F組）；⑦100 μmol/L Genistein組（G組）；⑧ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組（H組）；⑨1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組（I組）。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞于-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法

采用RT-PCR法檢測(cè)基因mRNA表達(dá)。Trizol提取細(xì)胞總RNA，按BcaBESTTM RNA PCR Kit說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄。采用Gene Runner軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增條件及循環(huán)數(shù)見(jiàn)表2。產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，GIS凝膠成像系統(tǒng)掃描及條帶灰度分析，以目的基因與β-actin灰度比值代表其相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Genistein對(duì)顆粒細(xì)胞CYP19 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均擴(kuò)增出一條清晰的大小約289 bp的CYP19特異片段。見(jiàn)圖1。

條帶分析結(jié)果顯示：1、5和10 μmol/L Genistein作用細(xì)胞48 h后，D、E、F組CYP19 mRNA表達(dá)顯著增加，顯著高于A(yíng)組（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G組CYP19 mRNA的表達(dá)與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后，分別加入1和10 μmol/L Genistein繼續(xù)處理48 h，H組CYP19 mRNA表達(dá)與D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），I組與F組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

與A組比較，*P < 0.05；A～I(xiàn)為A～I(xiàn)組；A組：0 μmol/L Genistein組（空白對(duì)照組）；B組：17β-E2（10 nmol/L）組；C組：0.1 μmol/L Genistein組；D組：1 μmol/L Genistein組；E組：5 μmol/L Genistein組；F組：10 μmol/L Genistein組；G組：100 μmol/L Genistein組；H組：ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組；I組：1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組

2.2 Genistein對(duì)顆粒細(xì)胞LRH-1mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均擴(kuò)增出一條清晰的大小約540 bp的LRH-1特異片段。見(jiàn)圖3。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（bp） ；A～I(xiàn)為A～I(xiàn)組；A組：0 μmol/L Genistein組（空白對(duì)照組）；B組：17β-E2（10 nmol/L）組；C組：0.1 μmol/L Genistein組；D組：1 μmol/L Genistein組；E組：5 μmol/L Genistein組；F組：10 μmol/L Genistein組；G組：100 μmol/L Genistein組；H組：ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組；I組：1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組

條帶分析結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L Genistein及10 nmol/L 17β-E2作用顆粒細(xì)胞48h后，B、D、E、F組LRH-1 mRNA表達(dá)增加，顯著高于A(yíng)組（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G組LRH-1 mRNA的表達(dá)與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后，分別加入1和10 μmol/L Genistein繼續(xù)處理48 h，H組LRH-1 mRNA表達(dá)與D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），I組則顯著低于F組（P < 0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Genistein可增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的敏感性[10]，但其作用機(jī)制尚不明確。還有報(bào)道Genistein可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞HepG2的CYP19表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞系芳香化酶的活性[11]。筆者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可上調(diào)衰老大鼠卵巢ER-α表達(dá)，并促其下游LRH-1和CYP19的表達(dá)[9，12]；離體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，Genistein可調(diào)節(jié)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞ER-α mRNA表達(dá)[13]。然而，大豆異黃酮對(duì)卵巢CYP19表達(dá)的影響是否通過(guò)ER-α介導(dǎo)，目前仍不明確。因此，本研究以卵巢顆粒細(xì)胞CYP19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控為切入點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，給予不同劑量的Genistein及ER-α阻斷劑Tamoxifen等因素處理細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)Genistein對(duì)CYP19基因表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。RT-PCR結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L Genistein作用顆粒細(xì)胞48 h，可上調(diào)CYP19 mRNA的表達(dá)；ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）對(duì)Genistein上調(diào)CYP19 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，提示Genistein對(duì)CYP19 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用可能并非通過(guò)ER-α途徑實(shí)現(xiàn)。

孤兒核受體LRH-1作為CYP19上游重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控卵巢芳香化酶的表達(dá)[14-15]。此外，17β-E2能高效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞LRH-1表達(dá)，通過(guò)ER-α直接結(jié)合于LRH-1啟動(dòng)子[16-17]。LRH-1是否介導(dǎo)ER和CYP19之間的信號(hào)傳遞，從而在卵巢局部發(fā)揮對(duì)雌激素生成的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L的Genistein及10 nmol/L 17β-E2均可上調(diào)卵巢顆粒細(xì)胞LRH-1 mRNA的表達(dá)，應(yīng)用ER-α阻斷劑Temoxifen預(yù)處理細(xì)胞后，可明顯抑制10 μmol/L Genistein對(duì)LRH-1mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，提示ER-α可能介導(dǎo)了Genistein對(duì)LRH-1表達(dá)的調(diào)控。然而，結(jié)合CYP19表達(dá)及前期ER-α mRNA表達(dá)的結(jié)果，筆者進(jìn)一步推測(cè)，Genistein雖可調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞ER-α、LRH-1和CYP19的表達(dá)，但對(duì)CYP19表達(dá)的調(diào)控可能并非通過(guò)ER-α介導(dǎo)。近年有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癌CYP19啟動(dòng)子Ⅰ的表達(dá)是通過(guò)一種新型膜性ER（G蛋白偶聯(lián)雌激素受體，GPER）介導(dǎo)的，與經(jīng)典ER無(wú)關(guān)，下游經(jīng)過(guò)LRH-1及ERK的信號(hào)通路激活CYP19[18-20]。由此推測(cè)，Genistein影響卵巢顆粒細(xì)胞CYP19的表達(dá)也可能是由GPER介導(dǎo)，這還需后續(xù)展開(kāi)更深入的研究證實(shí)。

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（收稿日期：2016-09-02 本文編輯：程 銘）