黃江南

摘要[目的]應(yīng)用固相萃?。⊿PE）及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS-MS）分析技術(shù)，建立養(yǎng)殖水體中的18種磺胺類(lèi)藥物殘留量測(cè)定方法。[方法]水樣中的磺胺類(lèi)藥物通過(guò)HLB萃取小柱富集后，以C18反相柱為分析柱，0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相，采用HPLC-MS-MS進(jìn)行定量分析。[結(jié)果]HPLC-MS-MS選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式測(cè)定，可同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖水體中的18種磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行定性和定量?；前奉?lèi)藥物的檢出限均低于1.0 ng/mL，方法的平均回收率為70%～120%。[結(jié)論]該方法能夠簡(jiǎn)便、快捷、有效地實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖水體中18種磺胺類(lèi)藥物殘留的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞固相萃取；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺類(lèi)藥物；養(yǎng)殖用水

中圖分類(lèi)號(hào)S949文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0088-03

Abstract[Objective] Using solid phase extraction （SPE） and HPLCMSMS analysis technology，determination method for 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water was established.[Method] Sulfa drugs in water sample were enriched through HLB extraction column，with C18 reversedphase column as analytical column，0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile as mobile phase，using HPLCMSMS to conduct quantitative analysis.[Result] Applying HPLCMSMS selective reaction monitoring （SRM） positive ion mode to determine，at the same time qualitative and quantitative analysis of 18 kinds of SAs in aquaculture water was conducted.The detection limits of SAs were less than 1.0 ng/mL，the range of the average recovery was 70%-120%.[Conclusion] The method is simple，quick and effective to realize rapid detection of 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water.

Key wordsSolid phase extraction；HPLCMSMS；SAs；Aquaculture water

磺胺類(lèi)藥物（SAs）是一種廣譜抗菌藥，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中可作為飼料添加劑，且在動(dòng)物疾病治療中也被廣泛應(yīng)用[1]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，磺胺類(lèi)藥物的不合理使用，導(dǎo)致其通過(guò)動(dòng)物糞便排入養(yǎng)殖水體的濃度增加。受污染的養(yǎng)殖水體匯入附近河流的地表水體后，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染及生態(tài)破壞問(wèn)題[2]。因此，有必要建立養(yǎng)殖水體中磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)方法，便于了解養(yǎng)殖水體及河流地表水體的污染狀況，及時(shí)采取有效的措施進(jìn)行控制，降低環(huán)境的污染和生態(tài)的破壞程度。

目前，針對(duì)水體中的磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-4]。酶聯(lián)免疫法作為篩選方法得到了廣泛應(yīng)用，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；液相色譜法靈敏度低、選擇性差。近年來(lái)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS-MS）技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)而被廣泛用于極性藥物的分析[5-6]。筆者利用固相萃?。⊿PE）富集凈化技術(shù)，結(jié)合HPLC-MS-MS分析技術(shù)，建立養(yǎng)殖水體中的18種磺胺類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定方法，以實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖水體中藥物殘留的快速檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料主要儀器設(shè)備：高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Agilent 6410B）；固相萃取裝置；氮吹儀；HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。

18種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SMPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺惡唑（Sulfamoxol）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxine）、磺胺甲惡唑（磺胺甲基異惡唑，SMZ）、磺胺異惡唑（磺胺二甲基異惡唑，SIZ）、磺胺喹惡啉（SQX）、苯甲?；前罚⊿ulfabenzamide）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺苯吡唑（SPP）。

主要試劑：甲醇；超純水；甲酸；乙腈；乙二胺四乙酸（EDTA）；硫酸。

1.2方法

1.2.1樣品前處理。采集1 L水樣保存在棕色瓶中。水樣經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾后，加入2 g EDTA，用0.2 mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH為3，待富集凈化。

HLB固相萃取小柱分別用6 mL甲醇和6 mL水活化。取500 mL處理過(guò)的水樣，以6 mL/min的速度過(guò)柱，然后用10 mL超純水淋洗，氮吹去除水分，再用6 mL甲醇洗脫，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)。

1.2.2儀器分析條件。

1.2.2.1色譜條件。色譜柱：Agilent Ecplipe Plus C18柱（100.0 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，流速為0.5 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2.2質(zhì)譜條件。電離模式：ESI（+），掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）；離子源溫度100 ℃；毛細(xì)管電壓4 000 V；洗脫溶劑溫度350 ℃；霧化氣流速 10 L/min，壓力344.74 kPa。其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1HPLC-MS-MS條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件。將常用的幾種試劑作為流動(dòng)相的有機(jī)相進(jìn)行試驗(yàn)，從基線(xiàn)穩(wěn)定情況及分離效果上看，使用0.1%甲酸水溶液及乙腈作為流動(dòng)相優(yōu)于其他試劑。

2.1.2質(zhì)譜條件。根據(jù)目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)，選擇ESI為離子源，在正離子電離模式下，用流動(dòng)注射進(jìn)樣方式對(duì)磺胺類(lèi)藥物的母離子進(jìn)行掃描，得到其準(zhǔn)分子離子峰，以適當(dāng)?shù)呐鲎材芰繉?duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃射，選擇響應(yīng)值最強(qiáng)的子離子作為定量離子，選擇響應(yīng)值相對(duì)較強(qiáng)的離子作為定性離子。選擇MRM掃描模式對(duì)母離子與子離子進(jìn)行碎裂電壓及碰撞能量的優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2固相萃取條件的優(yōu)化在淋洗HLB固相萃取小柱去除雜質(zhì)試驗(yàn)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用6 mL甲醇和6 mL水活化既能保證回收率又能得到較為滿(mǎn)意的除雜效果。因此，得到優(yōu)化后的萃取條件為取500 mL處理過(guò)的水樣，以6 mL/min的速度過(guò)柱，再用10 mL超純水淋洗，擠干氮吹去除水分，然后用6 mL甲醇洗脫，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)。

2.3定量及方法的精密度與準(zhǔn)確度養(yǎng)殖水體中含有的溶解性有機(jī)物濃度較高，可能導(dǎo)致HPLC-MS-MS信號(hào)的強(qiáng)弱變化不定，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

以磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）等18種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量?jī)?nèi)標(biāo)，配制2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果表明，18種磺胺類(lèi)藥物線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。當(dāng)信噪比S/N大于3的情況下，方法檢出限低于1 ng/mL；S/N大于10的情況下，方法定量限低于3 ng/mL。圖1為磺胺醋酰（SA）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

2.4加標(biāo)回收率試驗(yàn)以待測(cè)的樣品做添加回收試驗(yàn)，空白樣品為對(duì)照。在養(yǎng)殖水樣中添加5、20 μg/L的磺胺類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，測(cè)定18種磺胺類(lèi)藥物的回收率（n=5）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果如表3所示。

由表3可知，18種磺胺類(lèi)藥物的平均加標(biāo)回收率為70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.4%～5.1%。

2.5水樣檢測(cè)試驗(yàn)為了檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度，采取了2個(gè)養(yǎng)殖水體的水樣進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

由表4可知，水樣1的SA、Sulfamoxol、Sulfabenzamide 3種未檢出，其余的濃度低于檢出限；水樣2的SD、Sulfamoxol、SMZ、Sulfabenzamide未檢出，其余的濃度低于檢出限。

3結(jié)論

該試驗(yàn)建立了養(yǎng)殖水體中18種磺胺類(lèi)藥物殘留量的HPLC-MS-MS測(cè)定方法?；前奉?lèi)藥物的檢出限（RSN=3）低于1 ng/mL，定量限為（RSN=10）3 ng/mL。方法的平均回收率70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.4%～5.1%。該方法能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速地測(cè)定出養(yǎng)殖水體中的18種磺胺類(lèi)藥物殘留量，有效提高檢測(cè)分析中的工作效率，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)因藥物殘留問(wèn)題帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，保障我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的穩(wěn)定健康持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉佳佳，佘永新，劉洪斌，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中24種磺胺類(lèi)藥物殘留[J].分析試驗(yàn)室，2011，30（2）：9-13.

[2] 唐才明，黃秋鑫，余以義，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水環(huán)境中微量磺胺、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、甲氧芐胺嘧啶與氯霉素的檢測(cè)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（8）：909-913.

[3] 孫偉紅，冷凱良，王志杰，等.HPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中18種磺胺類(lèi)藥物殘留[J].食品科學(xué)，2009，30（24）：294-298.

[4] 朱世超，錢(qián)卓真，吳成業(yè).水產(chǎn)品中7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留量的HPLC-MS/MS測(cè)定法[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2012，8（1）：54-60.

[5] 趙鵬，劉鑫，孫希彥，等.HPLC-MS/MS法測(cè)定水產(chǎn)品中14種磺胺類(lèi)藥物 [J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2013，34（23）：80-83.

[6] 郭時(shí)金.水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（9）：29-30.