宋輝　李卉　王鋒

摘要[目的]使用多種培養(yǎng)成分組合，篩選出一個(gè)適合山羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的培養(yǎng)體系。[方法]采用慢病毒作為載體，攜帶多能因子，采用多種培養(yǎng)成分（培養(yǎng)基、血清和細(xì)胞因子）的組合培養(yǎng)山羊iPSCs，優(yōu)化其培養(yǎng)體系。[結(jié)果]用FBS代替KSR可以提高克隆的形成效率以及克隆的質(zhì)量，而用DMEM/F12代替KNOCKOUT-DMEM，iPSCs克隆的形成效率和克隆質(zhì)量沒(méi)有明顯的改善。帶有β-FGF的培養(yǎng)體系可以保持iPSCs未分化的狀態(tài)，而培養(yǎng)體系中只加LIF不能維持iPSCs未分化的狀態(tài)。[結(jié)論]該研究成功誘導(dǎo)出山羊iPSCs，且能在體外傳代培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；重編程；培養(yǎng)體系

中圖分類號(hào)S827文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）30-0131-03

Abstract[Objective]A culture system suitable for goatinduced pluripotent stem cells （iPSCs） was screened by using combination of various culture components.[Method]With the lentivirus as vector carrying pluripotency factor，goat iPSCs were cultured with a variety of culture components （culture medium，serum and cytokine） to optimize the culture system.[Result]The forming efficiency and clone quality of clones could be improved by FBS instead of KSR.The forming efficiency and clone quality of iPSCs clones were not improved by DMEM /F12 instead of KNOCKOUTDMEM.The culture system with βFGF could maintain the undifferentiated state of iPSCs，while only LIF could only maintain the undifferentiated state of iPSCs in the culture system.[Conclusion]Goat iPSCs were successfully induced and cultured in vitro.

Key wordsInduced pluripotent stem cells；Reprogramming；Culture system

胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）是從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和早期胚胎的生殖腺分離的多能細(xì)胞。在體外適宜條件下，ESCs可以保持未分化狀態(tài)并且無(wú)限增殖，同時(shí)可以分化為機(jī)體的任何組織細(xì)胞。ESCs對(duì)于胚胎正常發(fā)生及其異常發(fā)育、開(kāi)發(fā)合成藥物和胚胎瘤檢測(cè)的研究具有重要的意義，同時(shí)可為組織移植、器官置換和基因治療等提供重要的幫助。除此之外，ESCs在畜牧業(yè)生產(chǎn)上也有廣泛的用途。ESCs與轉(zhuǎn)基因技術(shù)及體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合能夠提高核移植效率，從而提高家畜的生產(chǎn)性能和抗病性能。山羊是一種重要家畜，科研人員試圖建立山羊等家畜ESCs，但是由于不能確定建系所需最適合的胚胎階段和家畜ESCs最佳的培養(yǎng)體系，導(dǎo)致家畜ESCs一直沒(méi)有建系成功[1]。該研究使用地方品種波雜山羊耳成纖維細(xì)胞作為體細(xì)胞，通過(guò)慢病毒感染進(jìn)行體細(xì)胞重編程，獲得波雜山羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（giPSCs），比較分析山羊iPSCs最優(yōu)的培養(yǎng)體系，以期篩選出一個(gè)適合山羊ESCs的培養(yǎng)條件。

1材料與方法

1.1主要試劑KNOCKOUT-DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、血清替代物（KSR）、非必需氨基酸（NEAA）、雙抗、無(wú)鈣鎂PBS緩沖液、胰蛋白酶、谷氨酰胺、二甲基亞砜（DMSO）、β-巰基乙醇（β-ME）、脂質(zhì)體（Lipofectamine TM 2000）均購(gòu)置于美國(guó)Life公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)置于美國(guó)Omega公司； DNA Maker購(gòu)置于日本TaKaRa公司；絲裂霉素-C（MIT-C）購(gòu)置于瑞士Roche公司；白細(xì)胞抑制因子（LIF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（β-FGF）購(gòu)置于美國(guó)Peprotech公司。

1.2方法

1.2.1山羊耳成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。 除凈山羊耳組織上的毛發(fā)，再用碘酊消毒，乙醇脫碘。用滅過(guò)菌的眼科剪迅速剪下一塊大小合適的皮膚組織，放在加有雙抗的滅菌PBS帶到實(shí)驗(yàn)室。將滅菌好的耳組織放到一個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，拿到超凈工作臺(tái)，用滅菌的手術(shù)刀片將毛發(fā)徹底清理干凈，浸泡在70%乙醇中30 s進(jìn)行滅菌，PBS漂洗3遍。用消毒的眼科剪和眼科鑷取下耳的軟骨組織，將剩余的皮膚組織剪成1 mm3的組織塊。用消毒彎頭巴氏吸管將小組織塊轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用彎頭巴氏吸管使組織塊以合適的密度均勻分布在瓶底上，放在培養(yǎng)箱中3～4 h。加入2 mL培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，第2天補(bǔ)加3～4 mL培養(yǎng)液，每隔2～3 d觀察并換液。待細(xì)胞匯合至50%～60%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。由于成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞對(duì)胰酶更敏感，前3代傳代后，在顯微鏡下看到細(xì)胞剛變圓即終止消化，只收集懸浮的細(xì)胞，這樣便可得到純度比較高的成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)，即可冷凍保存供長(zhǎng)期使用。

1.2.2飼養(yǎng)層細(xì)胞制備。 以10 μg/mL濃度絲裂霉素C（Mitomycin-C）處理小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF） （80%～90%融合為宜），置培養(yǎng)箱中2.5 h。取新的培養(yǎng)皿，加0.1%明膠（Gelatin）溶液覆蓋預(yù)處理30 min以上。取出Mitomycin-C處理好的MEF，吸棄廢液，用37 ℃預(yù)熱DPBS洗5遍，用適量胰酶消化成單細(xì)胞懸液。取出0.1%Gelatin處理的培養(yǎng)皿，吸出Gelatin，將MEF的細(xì)胞懸液按適當(dāng)?shù)拿芏蠕伆?。鋪好的飼養(yǎng)層在3 d內(nèi)有效，可以支持iPSCs生長(zhǎng)并維持其全能性。

1.2.3山羊iPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的建立。 感染前，在6孔板的一個(gè)孔里鋪上羊耳成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞匯合到80%時(shí)，加入病毒感染液感染（每孔的感染液為每種病毒濃縮液按照1∶1∶1∶1的比例加入到1 mL體細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻）。24 h后將病毒感染液吸出，加入體細(xì)胞培養(yǎng)液，24 h后重復(fù)感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纖維細(xì)胞，按一定的比例鋪到事先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上，每天換液，在第6天用ESCs培養(yǎng)基代替體細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到出現(xiàn)克隆（表1）。在病毒感染后12～15 d出現(xiàn)小的ESCs樣的克隆。繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，克隆不斷變大，準(zhǔn)備克隆的挑取。用1 mL無(wú)菌注射器的針尖將克隆分成由幾十個(gè)細(xì)胞組成的小克隆，然后將這些小克隆傳到24孔板上，1個(gè)克隆傳1個(gè)孔，24孔板事先已經(jīng)鋪好飼養(yǎng)層。5～7 d后，用1 mL無(wú)菌注射器的針尖對(duì)24孔板中的克隆進(jìn)行第2次傳代，方法同上，其中3/4的克隆傳到鋪有飼養(yǎng)層的12孔板或者6孔板（根據(jù)克隆數(shù)量的多少而定），剩下1/4的克隆傳到鋪有飼養(yǎng)層的48孔板上，標(biāo)記清楚，一一對(duì)應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1羊耳成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

組織塊貼壁2～3 d后，可以在顯微鏡下看到組織塊周圍長(zhǎng)出上皮細(xì)胞，隨后成纖維細(xì)胞沿組織塊周圍開(kāi)始生長(zhǎng)。5 d后成纖維細(xì)胞大量擴(kuò)增，生長(zhǎng)迅速，表現(xiàn)出很強(qiáng)的分裂增殖能力（圖1A、B）。待原代細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，中間夾雜著一些卵圓形的上皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3～4代的傳代即可除去混雜的上皮細(xì)胞，得到純度很高的成纖維細(xì)胞。

2.2山羊iPSCs培養(yǎng)條件

由表2可知，

用FBS代替KSR可以提高克隆的形成效率以及克隆的質(zhì)量，而用DMEM/F12代替KNOCKOUT-DMEM，iPSCs克隆的形成效率和克隆質(zhì)量沒(méi)有明顯改善。帶有β-FGF的培養(yǎng)體系可以保持iPSCs未分化的狀態(tài)，而培養(yǎng)體系中只加LIF不能維持iPSCs未分化的狀態(tài)，說(shuō)明β-FGF對(duì)于羊iPSCs多能性的維持是必需的（圖2A、B）。

3結(jié)論與討論

家畜的ESCs一直沒(méi)有建系成功，一個(gè)很重要的原因是在分離和培養(yǎng)家畜ESCs時(shí)，一直都是用人或鼠的ESCs培養(yǎng)條件。雖然相關(guān)研究人員做了很多嘗試，但是仍然不能確定家畜ESCs最佳的培養(yǎng)條件[2-6]。

Ren等[7]研究人員使用DMEM/F12+20%KSR誘導(dǎo)產(chǎn)生山羊iPSCs，在整個(gè)重編程以及后期iPSCs的培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中一直要添加1 μg/mL DOX，目的是讓外源轉(zhuǎn)錄基因持續(xù)表達(dá)，從而維持山羊iPSCs未分化的狀態(tài)。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在此試驗(yàn)中得到的山羊iPSCs，內(nèi)源性的多能基因并沒(méi)有被重新激活，一旦iPSCs的培養(yǎng)液中不添加DOX，外源多能基因發(fā)生沉默，iPSCs會(huì)自動(dòng)分化。在此試驗(yàn)的誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系中使用MEF作為飼養(yǎng)層，沒(méi)有添加任何細(xì)胞因子。Bao等[8]研究人員建立綿羊iPSCs過(guò)程中也使用相同的誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系。Li等[9]建立綿羊iPSCs過(guò)程中，使用2種培養(yǎng)體系：Knock-out DMEM+20%KSR+4 ng/mL人源β-FGF和Knock-out DMEM+20% FBS+4 ng/mL人源β-FGF，結(jié)果表明，添加FBS可以顯著地增加重編程的效率，但是培養(yǎng)液中仍然要添加DOX去維持外源轉(zhuǎn)錄基因的持續(xù)表達(dá)，否則，誘導(dǎo)效率會(huì)很低[9]。Liu等[10]使用DMEM+20% FBS+4 ng/mL人源β-FGF培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)出綿羊iPSCs。

該試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，在干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系KNOCKOUT-DMEM+KSRK中分別添加人源LIF、人源β-FGF，以及兩者都加，結(jié)果表明，在培養(yǎng)體系中添加LIF無(wú)法維持山羊iPSCs未分化的狀態(tài)，而添加β-FGF或者兩者都加可以維持山羊iPSCs未分化的狀態(tài)，說(shuō)明培養(yǎng)液中必須添加人源的β-FGF才可以維持山羊iPSCs未分化狀態(tài)，但是試驗(yàn)中培養(yǎng)山羊iPSCs使用的培養(yǎng)液添加的是人源β-FGF，對(duì)于維持山羊iPSCs未分化狀態(tài)最佳的細(xì)胞因子是什么，還無(wú)法下肯定的結(jié)論。

家畜ESCs和iPSCs建系經(jīng)常使用培養(yǎng)基DMEM/F12和血清FBS，結(jié)果表明使用FBS對(duì)于山羊iPSCs未分化狀態(tài)的維持要優(yōu)于KSR，這一點(diǎn)與Li等[9]的試驗(yàn)結(jié)論相似。但是KSR是一個(gè)成分明確的血清替代物，而FBS的成分很復(fù)雜，給一些干細(xì)胞水平研究增加了一些不確定因素，但是可以得知，在FBS中含有的一些KSR中沒(méi)有的成分，對(duì)于羊iPSCs未分化狀態(tài)的維持具有一些有益的幫助，這些成分是什么還需要進(jìn)一步的研究確定。

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