高志瑩，洪霞，劉琦，錢瀅文，周鑫魁，何海寧

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

UPLC-MS/MS同時測定肉湯中5種罌粟殼生物堿

高志瑩1，2，洪霞1，2，劉琦1，2，錢瀅文1，2，周鑫魁1，2，何海寧1，2

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定肉湯中5種罌粟殼生物堿含量的方法。肉湯樣品用0.1 mol/L鹽酸提取，經ProElut PXC固相萃取柱富集凈化后，5%氨水-甲醇溶液洗脫。采用Thermo Hypersil Gold色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）分離，ESI正離子掃描，多反應監(jiān)測模式采集測定。3個濃度添加水平的回收率在71.8%～112.5%之間，相對標準偏差（RSD）為4.1%～11.0%（n=6）。嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的檢出限分別為1.2、0.8、0.4、0.05、0.04 μg/kg。本方法可用于同時檢測肉湯中5種罌粟殼生物堿。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法；肉湯；固相萃取；罌粟殼生物堿

罌粟殼為罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，具有斂肺、澀腸、止痛等功效[1]。同時，它也是一種毒品，其果實中含嗎啡（Morphine）、可待因（Codeine）、蒂巴因（Thebaine）、罌粟堿（Papaverine）、那可丁（Noscapine）等20多種生物堿。罌粟殼中的生物堿雖然含量較少，但如果長期食用含有這類毒品的食物，會出現(xiàn)發(fā)冷、出虛汗、乏力、面黃肌瘦、犯困等癥狀，嚴重時可能對神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成損害，甚至出現(xiàn)內分泌失調等癥狀，嚴重危害消費者的健康[2]。國家衛(wèi)生部、工商總局早在2005年就發(fā)布了《關于加強罌粟籽食品監(jiān)督管理工作的通知》，規(guī)定罌粟籽僅允許用于榨取食用油脂，不得在市場上銷售或用于加工其他調味品[3]。本文針對牛肉拉面肉湯中的5種罌粟殼生物堿進行檢測，能夠高效、準確的對大批樣品進行處理分析。

目前，針對食品中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁的檢測方法，發(fā)布了1項地方標準[4]。文獻報道的主要有酶聯(lián)免疫法[5－6]、薄層色譜法[7－8]、分子生物法[9－10]、示波極譜法[11]、氣相色譜法[12－13]、氣－質聯(lián)用法[14－16]、液相色譜法[17－21]、液－質聯(lián)用法[22－30]、飛行時間質譜法等[31]。其中，酶聯(lián)免疫法存在交叉反應，特異性較差；氣相色譜法和氣－質聯(lián)用法前處理操作步驟復雜；液相色譜法靈敏度較低；飛行時間質譜雖有較高的靈敏度及準確度，但儀器價格昂貴難以普及。超高效液相色譜能極大地提高分析速度，且具有高分辨率、高靈敏度，定性、定量準確，檢測限低的特點，成為此類藥物檢測的主要方法。本試驗采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜儀，ESI正離子掃描、多反應監(jiān)測模式，對肉湯中的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁進行同時測定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀（UltiMate 3000/TSQ Quantum Access MAX）、Hypersil Gold色譜柱（100 mm× 2.1 mm×1.9 μm）：美國Thermo公司；高速冷凍離心機（CF16RXⅡ）：日本Hitachi公司；渦旋混勻器（VORTEX 3）：德國IKA公司；真空離心濃縮儀（miVac）：英國GeneVac公司；超聲器（SB－5200DTN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平（JJ500）：常熟雙杰測試儀器公司；ProElut PXC固相萃取柱（200 mg，6 mL）：迪馬科技有限公司。

罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合標準溶液：美國o2si公司。標準儲備液：甲醇溶解并稀釋，置于－18℃保存，可使用半年。標準工作液：使用前用流動相稀釋配制成適合濃度的混合標準工作液。

甲醇、甲酸為色譜純試劑（Fisher）；試驗用水為超純水；鹽酸、氨水為分析純試劑。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

準確稱取10 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 0.1 mol/L的鹽酸，渦旋混勻后超聲提取10 min，在4℃下以8 000 r/min的速度離心5 min，收集清液于另一50 mL離心管中待凈化。若含有油脂，可加入10 mL石油醚，渦旋10 s后離心，棄去有機相，下層清液待凈化。

1.2.2 凈化

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化固相萃取柱，保持柱體濕潤。將全部上清液以約2滴/秒～3滴/秒的流速通過已活化的固相萃取柱，用5 mL甲醇、5 mL水淋洗，棄去全部流出液，在65 kPa負壓下減壓抽干5 min以上。然后用6 mL甲醇－氨溶液（含體積分數(shù)5%氨水的甲醇）洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，于真空離心濃縮儀中濃縮至近干，氮氣吹干后用流動相溶解并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后待測。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm× 1.9 μm）；流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution table

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離；掃描方式：ESI正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：3.5 kV；霧化氣溫度：200℃；毛細管溫度：320℃；鞘氣：12 L/min；輔助氣：1.5L/min。5種生物堿成分質譜分析參數(shù)見表2。

表2 質譜分析參數(shù)Table 2 ESI-MS/MS analysis parameters

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取條件優(yōu)化

罌粟堿、可待因、蒂巴因、那可丁為堿性有機毒物，嗎啡為兩性有機毒物，它們都能與酸作用生成易溶于水的鹽。由于肉湯樣品中含有多種調味料，成分復雜，而油脂成分不是很多，所以采用酸性水溶液（0.1 mol/L鹽酸）混勻及提取樣品，將目標化合物溶于水相后用混合型陽離子固相萃取柱富集凈化，淋洗除雜后以堿性有機溶劑洗脫，可同時有效提取5種目標化合物，減少雜質的干擾。

2.1.2 凈化方式選擇

肉湯樣品中罌粟殼生物堿的提取和凈化方法主要有液液萃取法、QuEChERS法和固相萃取法等。液液萃取是在堿性條件下采用氯仿、乙醚或乙酸乙酯進行萃取，方法操作復雜且試劑為易揮發(fā)的有毒有害液體，不適用于大批量樣品的凈化。本試驗考察了用QuEChERS法提取凈化5種生物堿的效果。樣品經乙腈提取，再經PSA（乙二胺－N－丙基硅烷）填料、無水硫酸鎂、C18粉末富集凈化后直接測定，該方法操作快捷、簡單，但基質干擾物多，凈化效果差，回收率低（50%左右）。其次還考察了3種固相萃取柱富集凈化5種生物堿的效果。分別為稀鹽酸溶液過混合型強陽離子PXC柱、乙酸銨緩沖溶液過混合型弱陽離子PWC柱、弱堿性溶液過親水親脂平衡PLS柱。結果表明PXC柱的洗脫回收率（71.8%～112.5%）明顯高于PWC柱（45.3%～72.5%）和PLS柱（33.4%～68.2%），因此本試驗選用PXC柱作為SPE凈化柱。

2.2 儀器分析條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件

5種罌粟殼生物堿為極性到中等極性化合物，使用Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）色譜柱，0.1%甲酸水－甲醇流動相梯度洗脫，提高了離子化效率，有利于色譜峰的分離及峰形的改善。使5種化合物在5 min內完全分離。

2.2.2 質譜條件

采用蠕動注射泵穩(wěn)定、連續(xù)的注射標準溶液優(yōu)化質譜條件，確定每種被測組分的母離子，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子作為定性與定量離子。采用ESI源，正離子多反應監(jiān)測模式最大程度的檢測目標離子，使5種生物堿的質譜靈敏度最優(yōu)。在上述色譜質譜條件下，標準溶液、空白樣品和加標樣品的總離子流圖見圖1。從圖中可見5種化合物的峰形均較好，未見明顯的干擾峰。

圖1 標準溶液和樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of standard solution and sample

2.3 樣品基質效應的消除

用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法分析樣品時，基質效應會影響定量檢測的準確性。為消除樣品基質效應，可用陰性樣品提取液作為稀釋液配制標樣，可使標樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品的基質效應。試驗比較了標準溶液和基質標準溶液的信號響應差別。結果表明：基質效應使嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁的信號強度分別降低了約69.3%、63.0%、77.3%、62.2%和68.3%，因此使用基質標準溶液進行定量很有必要。

2.4 線性關系、檢出限、定量限、回收率及精密度

2.4.1 線性關系和檢出限、定量限

用陰性基質溶液配制嗎啡和可待因濃度為5、25、50、100、250、500 μg/L，蒂巴因、罌粟堿和那可丁濃度為1、5、10、20、50、100 μg/L的系列混合標準溶液，分別進樣，以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。根據(jù)檢出限含量處的信噪比（RSN）等于3的原則確定5種化合物的檢出限，根據(jù)定量限含量處的信噪比（RSN）等于10的原則確定5種化合物的定量限。其線性關系和檢出限、定量限見表3。

表3 5種化合物的線性分析及檢出限、定量限Table 3 Linear analysis，detection limits and of five compounds

2.4.2 回收率和精密度

在10 g陰性樣品中添加不同量的混合標準溶液，制得3個水平的標準添加樣品，其中嗎啡、可待因的添加濃度為0.5、2.5、10.0 μg/kg，蒂巴因、罌粟堿、那可丁的添加濃度為0.1、0.5、2.0 μg/kg，每個水平添加樣品做6個平行試驗。按本試驗方法操作，外標校準曲線法定量?；厥章省⑾鄬藴势钜姳?。

表4 5種化合物的回收率及精密度試驗結果（n=6）Table 4 Recovery rates and precision of five compounds

樣品在該添加范圍內，回收率在71.8%～112.5%之間，相對標準偏差（RSD）在4.1%～11.0%之間。

3 結論

本文建立了測定肉湯樣品中罌粟殼生物堿的超高效液相色譜串聯(lián)質譜分析方法。在樣品凈化時采用ProElut PXC固相萃取柱進行富集凈化，同時對其他分析參數(shù)做了進一步優(yōu)化，改進了提取和凈化效果。分析時采用質譜ESI源正離子掃描、多反應監(jiān)測模式采集測定，在5 min內可完成5種化合物的完全分離，提高了方法的靈敏度。3個濃度添加水平的回收率為71.8%～112.5%，相對標準偏差（RSD）為4.1%～11.0%（n=6）。嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的檢出限分別為1.2、0.8、0.4、0.05、0.04 μg/kg。方法線性良好，樣品的標準添加回收率試驗及精密度試驗顯示方法定量準確，重現(xiàn)性好，可以作為實際樣品中罌粟殼生物堿測定的分析方法。

[1]國家藥典委員會.中國藥典2015(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:584

[2]徐麗紅,王建清,陶秋,等.高效液相色譜同時測定3類食品中的5種罌粟殼生物堿[J].分析測試學報,2011,30(12):1387-1391

[3]朱振華,朱士新,陳璐,等.罌粟殼成分快速檢測方法在食品監(jiān)督中的應用[J].中國食物與營養(yǎng),2015,21(3):8-10

[4]上海市食品藥品監(jiān)督管理局.DB 31/2010-2012火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法[S].上海:上海市食品藥品監(jiān)督管理局,2012

[5] 鈕偉民,毛云中,戴維杰.ELISA檢測罌粟堿方法學研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2003,13(5):575-577

[6] 張東升,蔡建榮,蔡正森,等.ELISA法快速測定火鍋底料及調料中的罌粟堿[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2004,14(2):208-209

[7]徐平聲,馬虹英,雷鵬,等.薄層色譜法對6種常見麻醉藥品的定性定量分析[J].中國藥學雜志,2003,38(8):619-620

[8] 馬明善,李巖,尤杰玉.摻偽食品中罌粟殼的紙層色譜測定法[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,1992,2(6):375

[9]劉洋,嚴羅美,曹程明.復合調味粉中罌粟成分的PCR檢測方法[J].食品工業(yè)科技,2011,32(6):407-413

[10]劉洋,張輝,陸志蕓,等.復合調味粉中罌粟成分的實時熒光PCR檢測方法[J].中國調味品,2011,36(7):93-96,120

[11]陶銳,高舸,楊元.火鍋湯料中嗎啡的示波極譜測定[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,1994,4(3):140-143

[12]李永芳,付耀華,侯曉燕.氣相色譜法測定食品中罌粟殼殘留的研究與應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2000,10(1):38-40

[13]范翔,馮家力,陳東洋,等.雙柱分離-氣相色譜法測定火鍋底料中罌粟堿[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015,25(14):2296-2298,2301

[14]張艷萍,廖華樂,肖兵,等.GC/MS測定食品中罌粟堿和嗎啡含量[J].衛(wèi)生研究,2011,40(4):512-513

[15]李鳳貞,區(qū)文凱,莫嘉延.GC/MS法檢測湯料中罌粟生物堿提取條件探討[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010,20(11):2784-2785,2788

[16]沈平,謝朝梅,謝燕湘,等.GC/MS法直接測定食品中罌粟殼提取物的殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015,25(20):3466-3468

[17]張靖.食品中罌粟堿、嗎啡、可待因含量的液相色譜檢測法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(1):72-73

[18]馮麗娟,王庭欣,趙志磊,等.超聲-微波協(xié)同萃取-HPLC檢測摻罌粟殼肉湯中的生物堿[J].河北大學學報(自然科學版),2009,29(3): 291-294

[19]信海紅,王庭欣,朱路甲,等.超聲波微波萃取-高效液相色譜法檢測肉湯中的罌粟堿[J].中國食品添加劑,2012(4):250-252

[20]皮力,胡鳳祖,師治賢.高效液相色譜-熒光檢測法測定罌粟籽和火鍋湯料中的罌粟堿[J].色譜,2005,23(6):639-641

[21]谷巖,劉廣福,張元,等.固相萃取-高效液相色譜法測定湯料中罌粟殼提取物殘留量[J].理化檢驗-化學分冊,2011,47(12):1411-1413

[22]王力清,酈明浩,李錦清,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法高通量快速測定調料中罌粟殼生物堿含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38 (8):168-171

[23]張林田,黃少玉,陸奕娜,等.固相萃取/HPLC-MS/MS檢測食品中嗎啡等五種罌粟殼生物堿殘留[J].分析試驗室,2014,33(6):722-725

[24]顧萬江,周春艷,唐曉琴,等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定食品中5種生物堿[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2014, 24(17):2481-2484

[25]李航,賀亞玲,陳小泉,等.QuEChERS/UPLC-MS測定火鍋調料中罌粟殼(粉)的研究[J].食品與藥品,2014,16(4):284-287

[26]毛丹,簡龍海,鄭榮,等.火鍋食品中罌粟殼生物堿的液相色譜-串聯(lián)質譜測定法[J].環(huán)境與健康雜志,2012,29(1):88

[27]王柯,鄭榮,簡龍海,等.火鍋調料中5種生物堿成分的液相色譜-串聯(lián)質譜測定法[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,21(2):363-365

[28]劉敏敏,張朝正,李延志,等.液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測火鍋底料中罌粟殼[J].食品研究與開發(fā),2012,33(12):91-94

[29]楊潔,王智,張輝珍,等.液相色譜-質譜法測定火鍋湯料中的罌粟堿[J].食品科學,2014,35(22):2243-2246

[30]劉艷琴,王浩,楊紅梅,等.液相色譜-質譜聯(lián)用技術測定食品中罌粟堿殘留[J].食品研究與開發(fā),2010,31(7):130-132

[31]顧萬江,唐曉琴,周春艷,等.超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查食品中5種生物堿[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2014, 24(16):2337-2340,2345

Determination of 5 Opium Poppy Husk Alkaloids in Broth by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

GAO Zhi-ying1，2，HONG Xia1，2，LIU Qi1，2，QIAN Ying-wen1，2，ZHOU Xin-kui1，2，HE Hai-ning1，2
（1.Gansu Business Technology Institute，Lanzhou 730010，Gansu，China；2.Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.，Ltd.，Lanzhou 730010，Gansu，China）

A method for simultaneous determination of 5 opium poppy husk alkaloids in broth sample was developed by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.Broth samples were extracted by 0.1 mol/L hydrochloric acid，then concentrated and purified by ProElut PXC solid-phase extraction column，after that were eluted by 5%ammonia-methanol.The separation was performed on a Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）column，and detected by mass spectrometry using electrospray ionization（ESI）in positive mode under multiple reaction monitoring mode.The recovery rates of the spiked sample was in the range of 71.8%-112.5%and the relative standard deviation（RSD）was between 4.1%to 11.0%（n=6）.The detection limits for morphine，codeine，thebaine，papaverine and narcotine were 1.2，0.8，0.4，0.05 μg/kg and 0.04 μg/kg.This method can be successfully applied to the simultaneous detection for 5 opium poppy husk alkaloids in broth.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；broth；solid-phase extraction；alkaloid in opium poppy husk

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.028

2016-08-25

甘肅省動物源性制品安全分析與檢測技術重點實驗室（1309RTSA025）；甘肅省動物源性制品快速檢測工程技術研究中心（1009FTGA018）；中-馬清真食品國家聯(lián)合實驗室食品檢測平臺建設（1505JTCA017）

高志瑩（1983—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品安全分析與檢測。