楊倩，劉建輝，蔣彤，董莉莉，段宏玉，孫紀錄

（1.河北農業(yè)大學理工學院，河北滄州061100；2.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001）

幾丁質脫乙酰酶的研究進展

楊倩1，劉建輝1，蔣彤1，董莉莉1，段宏玉1，孫紀錄2，*

（1.河北農業(yè)大學理工學院，河北滄州061100；2.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001）

幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）是可以催化幾丁質脫乙?；磻蓺ぞ厶堑拿割?。殼聚糖因其具有抗菌、抗癌、抗病毒等特性，在醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)具有廣闊的應用前景。對CDA的研究概況進行了綜述，包括酶學性質、催化機理、分離純化的方法等，同時對CDA產生菌的篩選方法及過程做了簡要的闡述，并對CDA今后的重點研究方向進行了展望。

幾丁質脫乙酰酶；幾丁質；殼聚糖；脫乙酰

幾丁質又稱甲殼素，是由N－乙酰－D－葡萄糖胺以β－1，4糖苷鍵連接而成的天然高分子多糖，在自然界中含量僅次于纖維素。但由于其溶解性差，應用受到一定限制[1]。幾丁質的衍生物殼聚糖，又稱脫乙酰甲殼素，是天然多糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖。殼聚糖具有抗菌、抗癌、抗病毒等作用，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性，在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)得到了廣泛應用[2]。目前，生產殼聚糖主要是采用化學方法。化學方法需要使用大量的濃堿，除反應時間長、成本高、耗能大、產品質量不穩(wěn)定等缺點外，反應過程中生成的某些有毒的物質（如肼等），也會對環(huán)境造成嚴重的污染[3]。而采用生物酶法降解幾丁質可以克服化學方法的缺點。幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）是催化幾丁質轉化為殼聚糖的關鍵酶，能夠脫去幾丁質分子中的乙酰基生成殼聚糖。本文針對幾丁質脫乙酰酶的研究概況進行綜述，以期為后續(xù)幾丁質脫乙酰酶的進一步研究與應用提供理論支持。

1 CDA的研究概況

1.1 CDA的酶學性質

由于CDA的來源不同，其酶學性質也存在差異性。到目前為止，自然界所發(fā)現的CDA都是糖蛋白。CDA熱穩(wěn)定性良好，大多數CDA的最適溫度為50℃～60℃。而最適pH差異較大，一般胞外酶的最適pH為7～12，胞內酶最適pH為4.5～6。大部分CDA的等電點（isoelectric point，pI）都在酸性范圍內[3－4]。影響CDA酶學性質的因素主要有溫度、pH、底物狀態(tài)及濃度、相對分子質量和金屬離子等。不同金屬離子對CDA酶學性質的影響不同，同種金屬離子也可能因其濃度不同而起相反的作用，比如對于紅球菌（Rhodococcus）所產的CDA，高濃度的Ca2+、Mn2+、K+抑制其酶活，而低濃度的Ca2+、Mn2+、K+卻是該酶的激活劑[5]。表1列舉了不同來源CDA的性質。

表1 不同來源CDA的性質Table 1 The property of the CDA from different sources

1.2 CDA的催化機理

在關于CDA催化機理的研究中，Martinou等以魯氏毛霉（Mucor rouxii）中的CDA為樣本，通過1HNMR和13CNMR光譜檢測，發(fā)現CDA水解乙?；姆磻嵌辔稽c進攻模式，即可同時脫除多個位點的乙?；摮阴；膫€數與作用點的個數有關[12]。CDA的作用機制與其他酶作用于多聚體底物的作用機制相近。據測試結果合理推測其水解過程可能為：CDA與幾丁質的N－乙酰－D－葡萄糖胺長直鏈結合，從結合位點的非還原端開始水解，依次脫除乙?；瓿珊笈c長鏈脫離，再結合另一條長鏈繼續(xù)作用[13－14]。此外，來源于菜豆炭疽菌的CDA可將殼二糖乙?；?－乙酰氨基－2－脫氧－D－吡喃葡萄糖－（1→4）－2－氨基－2－脫氧－D－葡萄糖，這是一種不常見的特殊催化產物。該CDA在3 mol/L乙酸鈉存在下，可以催化逆向脫乙酰反應[15]。

1.3 CDA的分離純化

純化CDA常用的方法主要為層析法。Kafetzopoulos等采用3步層析法將魯氏毛霉的粗酶提取物進行純化。純化倍數為97.3，得率11.9%，酶的比活力為2.968U/mg[16]。Tokuyasu等[17]對菜豆炭疽菌產生的粗酶提取物同樣通過3步層析法進行純化，達到電泳純。純化倍數為944、得率為4.05%、酶的比活力為18.4 U/mg[17]。Jeraj等將黑根霉（Rhizopus nigricans）的粗酶提取物采用2步層析法，分別通過CM凝膠色譜柱和DEAE－纖維色譜柱進行分離純化，達到電泳純。純化倍數為21.2、得率為5.2%、比活力為40.3 U/mg[18]。Pareek等將草酸青霉的粗酶液通過2步層析法對CDA進行了純化，達到電泳純。純化倍數為88.25、得率為11.06%、比活力為55.38 U/mg[11]。

1.4 產CDA的微生物種類

CDA在1974被首次報道，是由Araki和Ito在魯氏毛霉中發(fā)現的[19]，之后研究者們又在一些致病的真菌和細菌中發(fā)現了CDA的存在[20]。現已發(fā)現的產幾丁質脫乙酰酶的微生物種類較為廣泛，主要有細菌、放線菌、真菌等。部分重要的產CDA的微生物列于表2中。

表2 產CDA的微生物Table 2 The microorganisms producing CDA

2 產CDA微生物的篩選

篩選過程一般分為初篩和復篩。初篩是從平板篩選培養(yǎng)基上篩選得到可疑菌落，復篩即進一步確認可疑菌株是否能產幾丁質脫乙酰酶并測定其酶活力。

2.1 初篩的方法及過程

2.1.1 初篩的方法

初篩的方法主要有兩種。一是透明圈法，其原理是以膠體幾丁質作為唯一氮源制成平板篩選培養(yǎng)基，如果有能產生CDA的菌存在，便可以分解幾丁質產生透明圈。通過透明圈的大小判斷微生物對幾丁質的分解能力和CDA的活性。此法的不足之處在于：膠體幾丁質的平板是半透明的，所以觀察效果并不明顯[32]。二是變色圈法，其原理是將對硝基乙酰苯胺作為平板篩選培養(yǎng)基的底物之一，可以脫去幾丁質乙?；奈⑸镆部梢悦撊ο趸阴１桨飞系囊阴；?，生成黃色的對硝基苯胺，這樣就可以通過平板篩選培養(yǎng)基上是否出現黃色以及黃色面積的大小來判斷是否有產生CDA的微生物存在和其脫乙?；哪芰Υ笮?。此法反應現象明顯，易于觀察，缺點在于對硝基乙酰苯胺有毒，難溶于冷水，高溫易分解，不易操作。

2.1.2 初篩的過程

根據實際情況采樣，采樣后應盡快進行富集培養(yǎng)，一般富集培養(yǎng)時間為3 d～7 d，再進行平板篩選，從平板篩選培養(yǎng)基上挑選可疑菌落進行劃線分離純化培養(yǎng)，最后接種到斜面培養(yǎng)基上進行保存。

2.2 復篩的方法及過程

2.2.1 CDA酶活力測定方法

由于天然幾丁質不溶于水，需經特殊處理后才能用作酶活力測定的底物。因此，CDA酶活力測定受到限制，使得CDA的研究進展緩慢。以下介紹幾種已報道的CDA酶活力測定方法。

2.2.1.1 比色法

CDA催化膠體幾丁質生成葡萄糖胺單體，再利用吲哚－鹽酸分光光度法測定反應終產物中糖胺的含量，計算CDA的酶活力[33]。其實驗原理是使用亞硝酸鹽脫除己糖胺的氨基生成己糖苷，吲哚與產物己糖苷在鹽酸溶液中發(fā)生顏色反應，通過測定顏色反應前后的吸光值，即可得出反應前后乙?；拿摮?。比色法實驗結果存在重現性較差的缺點。

2.2.1.2 放射法

其原理是將可溶性幾丁質中的乙酰基用放射性物質進行標記，將其作為底物應用CDA進行催化，反應結束后通過測定其中放射性乙酸的含量計算出CDA的催化效率。放射法存在成本高、操作繁瑣、耗時長等缺點[15]。

2.2.1.3 對硝基乙酰苯胺分光光度法

將對硝基乙酰苯胺作為反應底物，經CDA催化后生成對硝基苯胺。使用分光光度法測定反應后對硝基乙酰苯胺的吸光度與標準曲線對比，從而計算出CDA的酶活。此法操作簡單、準確度高，適合從大批量樣品中篩選目標菌株[34]。

2.2.2 復篩的過程

將初篩得到的菌株接種到相應的種子培養(yǎng)基，進行搖床培養(yǎng)，使其在種子培養(yǎng)基中能夠恢復活力并提前適應發(fā)酵條件。然后將種子培養(yǎng)液接種到相應的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基能提供給其較適宜的發(fā)酵產酶條件。培養(yǎng)適當時間后即可測其酶活力。

3 結論與展望

雖然幾丁質脫乙酰酶的研究目前取得了一定進展，但同時也存在許多問題。

3.1 在CDA的分離純化與催化機理方面

目前關于CDA分離純化的研究還比較少，分離純化方法單一，主要是層析法。隨著科學技術的進步應不斷簡化，以有利于實現CDA的工業(yè)化生產。CDA的催化機理的研究對其工業(yè)化生產至關重要，因此可以將此列為研究方向進行深入探究。

3.2 在篩選產CDA的微生物的研究方面

目前已在多種菌屬中篩選到能產CDA的菌。但是，由于篩選出來的產CDA的菌株大多活力不高，發(fā)酵提取的條件不成熟，調控機理尚未研究清楚，不能應用于工業(yè)化大規(guī)模生產。因此，通過誘變育種和分子生物學方法，選育和構建具有穩(wěn)定遺傳性狀的CDA高產菌株仍是未來重要研究方向。另外，天然幾丁質不能作為篩選產CDA菌的底物，因其晶體結構難以進行脫乙?；磻?，必須將其經過預處理。因此，研究幾丁質簡單快速的預處理方法，破壞其晶體結構也是今后研究的一個重點。

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Research Advance of Chitin Deacetylase

YANG Qian1，LIU Jian－h(huán)ui1，JIANG Tong1，DONG Li－li1，DUAN Hong－yu1，SUN Ji－lu2，*
（1.College of Science and Technology，Hebei Agricultural University，Cangzhou 061100，Hebei，China；2.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China）

Chitin deacetylase（CDA）is an enzyme which can catalyze deacetylase reaction in chitin generating chitosan.Chitosan has several excellent properties，such as antibacterial，anticancer，and antiviral，with wide application prospect in the medicine，chemical，and food industries.The research situation of CDA was reviewed，including enzymatic properties，catalytic mechanism，the method of separation and purification，etc. Furthermore，the screening methods and process of CDA producing strains were briefly introduced，and the future research direction of CDA was prospected.

chitin deacetylase；chitin；chitosan；deacetylation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.045

2016-08-25

河北省科技計劃項目“利用蟹殼和小球藻生產新型海洋多糖的關鍵技術研究及功能食品開發(fā)”（15273204D）

楊倩（1986—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全。*通信作者：孫紀錄（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術。