陳旭偉　郭錦芳　厲華卿

[摘要] 目的 分析大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的TGFβ-Smad信號通路參與機制及米非司酮的改善作用。 方法 將雌性SD大鼠隨機分為假手術組、子宮內(nèi)膜異位癥模型組、小劑量和大劑量米非司酮組（n=10）。采用免疫印跡法檢測各組大鼠異位組織中TGFβ-Smad信號通路的關鍵蛋白及細胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達。結果 子宮內(nèi)膜異位癥模型組大鼠的TGFβ-Smad信號通路關鍵蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表達均明顯增高（P<0.01）；促細胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達增強而Bcl-2表達降低（P<0.01）；米非司酮組大鼠的上述蛋白的異常得到顯著恢復（P<0.01或P<0.05），且大劑量組效果明顯優(yōu)于小劑量組（P<0.05）。 結論 米非司酮可通過抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常。

[關鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；TGFβ-Smad信號通路；米非司酮；細胞凋亡

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）09-0039-04

Study on the effect of mifepristone on the TGFβ-Smad mechanism of the pathogenesis of endometriosis in rats

CHEN Xuwei GUO Jinfang LI Huaqing

Department of Gynecology， Dongyang Peoples Hospital in Zhejiang Province， Dongyang 322100， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of TGFβ-Smad signaling pathway in the pathogenesis of endometriosis in rats and the improvement of mifepristone. Methods Female SD rats were randomly divided into sham operation group， endometriosis model group and mifepristone low dose group and high dose group（n=10）. The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signaling pathway and the expression of apoptosis proteins such as Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in ectopic tissues of rats were detected by immunoblotting method. Results The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signalling pathway such as TGFβ， Smad1， Smad2 and Smad3 were significantly increased in the rats in the endometriosis model group（P<0.01）； the expression of apoptosis proteins such as Bax and Caspase-3 was increased and the expression of Bcl-2 was decreased（P<0.01）； the abnormalities of the above proteins in the mifepristone group were significantly recovered（P<0.01 or P<0.05）， and the effect in the high dose group was significantly better than that in the low dose group（P<0.05）. Conclusion Mifepristone can improve the abnormalities of endometriosis in rats by inhibiting the activated TGFβ-Smad pathway.

[Key words] Endometriosis； TGFβ-Smad signaling pathway； Mifepristone； Apoptosis

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床上常見的婦科疾病，主要表征為內(nèi)膜細胞在不正常的位置生長[1，2]。子宮內(nèi)膜異位癥與多種因素相關，如遺傳因素、環(huán)境因素及機體的免疫功能等[3，4]。但是目前關于子宮內(nèi)膜異位癥確切發(fā)病機制尚不明確。TGFβ-Smad信號通路是細胞內(nèi)最常見的信號通路之一，參與了多種婦科疾病的發(fā)生及發(fā)展過程[5，6]。本研究旨在分析米非司酮對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的TGFβ-Smad信號通路的影響，為子宮內(nèi)膜異位癥的診治提供參考，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雌性清潔SD大鼠（上海斯萊克實驗動物中心提供），許可證號SYXK（滬）2008-0047，體重110～130 g。所有動物均性成熟但未交配。所有實驗動物在實驗前適應性培養(yǎng)1周。將雌性SD大鼠隨機分為假手術組（不進行子宮內(nèi)膜異位癥造模）、子宮內(nèi)膜異位癥模型組（進行子宮內(nèi)膜異位癥造模，不采用藥物治療）、小劑量和大劑量米非司酮組（n=10）。

1.2 方法

子宮內(nèi)膜異位癥造模：大鼠麻醉、固定，清潔消毒開腹處皮膚，開腹分離結扎大鼠左側子宮，縱向剪開宮腔，剝離子宮內(nèi)膜，宮體與右側腹膜壁層縫合，關腹，繼續(xù)飼養(yǎng)。

進行子宮內(nèi)膜異位癥造模后1周開始，喂給小鼠口服米非司酮（上海新華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H10950202），小劑量組每日給予1次，每次10 mg/kg，大劑量組每日給予1次，每次100 mg/kg，連服3 d。

1.3 免疫印跡法檢測相關蛋白的表達

取出大鼠的右側腹膜壁層組織，通過組織形態(tài)學觀察確認為子宮內(nèi)膜異位組織生長，即為造模成功，將造模成功的子宮內(nèi)膜組織充分勻漿后，加入等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳及半干法轉膜至硝酸纖維素膜。轉膜后將硝酸纖維素膜用脫脂牛奶封閉，然后與第一抗體（1∶500）溫孵4 h，無菌PBS漂洗3次后與HRP標記二抗（1∶200）室溫反應1 h漂洗后顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，進行蛋白表達的定量分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件，計量資料行t檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1模型組大鼠TGFβ蛋白的異常表達及米非司酮的干預作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TGFβ較假手術組高（P<0.01），小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖1。

2.2模型組大鼠Smad1/2/3蛋白的異常表達及米非司酮的干預作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Smad1、Smad2和Smad3蛋白較假手術組高（P<0.01），小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖2。

2.3模型組大鼠細胞凋亡蛋白的異常表達及米非司酮的干預作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Bax和Caspase-3蛋白的表達明顯高于假手術組，而Bcl-2表達明顯低于假手術組，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖3。

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床上常見的婦科疾病，嚴重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量[7]。子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床上多表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)異常及性交疼痛等，也可能出現(xiàn)周期性的尿頻、尿痛和尿血等[8，9]。子宮內(nèi)膜異位癥的確切發(fā)病機制尚不明確[10]，其主要治療手段是藥物和手術治療[11]。藥物治療療效不明顯，易復發(fā)，有一定的不良反應發(fā)生[12]。本文在分析大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的機制及米非司酮的改善作用時發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥模型組大鼠的TGFβ-Smad信號通路關鍵蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表達均明顯增高；促細胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達增強而Bcl-2表達降低；米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到顯著恢復，且大劑量組效果明顯優(yōu)于小劑量組。因此，米非司酮能夠通過抑制孕激素的分泌，改變垂體促性腺細胞出現(xiàn)形態(tài)結構，阻斷受體與孕酮結合并產(chǎn)生雌激素生物學效應[13]，抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常[14]，抗子宮內(nèi)膜增殖[15]，誘導異位內(nèi)膜發(fā)生變性、萎縮與壞死，治療子宮內(nèi)膜異位療效顯著，且不良反應小[16]。TGFβ-Smad信號通路參與了多種婦科疾病的病理學過程，且可以作為藥物治療的潛在靶點[17]。在研究Smad4在卵巢上皮癌組織中表達及意義的研究中發(fā)現(xiàn)Smad4蛋白可能與卵巢上皮癌的發(fā)展有一定的相關性[18]。在研究Smad4和MMP-9在卵巢上皮性癌組織中表達意義的研究中，也發(fā)現(xiàn)Smad4在卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且與基質(zhì)金屬蛋白酶9有密切的相關性，二者可以作為臨床診斷卵巢上皮癌預后的重要參數(shù)[19]。在對TGFβ1的表達與宮頸癌相關性的研究中也證實TGFβ1的表達與宮頸鱗癌的發(fā)展呈明顯的正相關性，且其可以作為宮頸癌早期診斷、治療及預后的重要指標[20]。本文在分析子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠發(fā)病機制的研究中也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TGFβ及Smad1、Smad2和Smad3蛋白的表達明顯高于假手術組，且差異有顯著統(tǒng)計學意義；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義，表明激活的TGFβ-Smad信號通路參與了大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程，米非司酮能夠通過抑制該信號通路的激活發(fā)揮改善作用。細胞凋亡是細胞的程序化死亡過程，也與婦科疾病的發(fā)病密切相關。本文也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Bax和Caspase-3蛋白的表達明顯高于假手術組，而Bcl-2表達明顯低于假手術組，且差異有顯著統(tǒng)計學意義；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義，表明細胞凋亡也參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生過程，且藥物也能夠通過抑制該過程發(fā)揮改善作用。

綜上，米非司酮能夠通過抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常。

[參考文獻]

[1] 王成鑫，周紅艷，黃萱，等. PTEN、EGFR和GH在子宮內(nèi)膜異位癥和異位惡變內(nèi)膜中的表達及意義[J]. 江漢大學學報（自然科學版），2013，12（5）：81-85.

[2] 郭孫偉.子宮內(nèi)膜異位癥的臨床試驗：現(xiàn)狀、反思、挑戰(zhàn)和機遇[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2014，9（7）：11-14.

[3] 楊必成，汪利群，王楓，等.子宮內(nèi)膜異位癥生物標記物的研究進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2014，14（11）：926-928.

[4] 余燚薇，趙瑞華.子宮內(nèi)膜異位癥相關盆腔粘連的發(fā)生機制淺析[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2015，12（5）：44-49.

[5] 周曼萍，何援利，喬琳，等.轉化生長因子-β_1及Smad2/3在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學，2014，23（12）：1844-1847.

[6] 程明軍，徐叢劍.子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制理論和學說[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，23（7）：561.

[7] Sun Y，F(xiàn)ang M，Davies H，et al.Mifepristone：A potential clinical agent based on its anti-progesterone and anti-glucocorticoid properties[J].Gynecol Endocrinol，2014，30（3）： 169-173.

[8] 盧齋，金松，陳華，等.米非司酮對子宮內(nèi)膜異位癥腹腔鏡術后復發(fā)及血清中IL-12 的研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39（12）：2962-2963.

[9] 李雷，冷金花.子宮內(nèi)膜異位癥及其治療對女性生育影響的研究進展[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，14（5）：393-396.

[10] 董倩，邱曉紅.血管生成及抗血管生成與子宮內(nèi)膜異位癥關系研究進展[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2012，9（3）：235-237.

[11] 陳清英.月經(jīng)黃體初期小劑量應用米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥35例療效觀察[J].醫(yī)學理論與實踐，2011， 24（4）：437-438.

[12] Guo SW，Liu M，Shen F，et al.Use of mifepristone to treat endometriosis：A review of clinical trials and trial-like studies conducted in China[J].Womens Health（Lond Engl），2011，7（1）：51-70.

[13] 張慰，劉彥.米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥研究進展[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2010，11（1）：71-72.

[14] 占長明.米非司酮的臨床應用[J].中國婦幼保健，2010， 25（31）：4948.

[15] 李琴，陳炳香，梁向華.腹腔鏡手術聯(lián)合米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥[J].江蘇醫(yī)藥，2010，36（21）：2558-2559.

[16] 李穗湘，羅萍香.米非司酮與內(nèi)美通用于子宮內(nèi)膜異位癥術后治療的療效比較[J].中華現(xiàn)代婦產(chǎn)科學雜志，2005， 2（1）：8.

[17] 高娜，吳濤.TGF-β在卵巢癌中作用的研究進展[J].大連醫(yī)科大學學報，2012，10（4）：409-413.

[18] 陳鳳云，胡小青.Smad4及P21WAF1/CIP1在卵巢上皮癌組織中的表達及意義[J].實用癌癥雜志，2014，8（11）：1360-1363.

[19] 何陳云，湯春輝，章建國.Smad4和MMP-9在卵巢上皮性癌組織中的表達及臨床意義[J].南通大學學報（醫(yī)學版），2012，12（6）：510-512.

[20] 羅麗麗，程欣，蔡紅兵.TGF-β_1的表達、HPV16E7基因多態(tài)性與宮頸癌的相關性[J].武漢大學學報（醫(yī)學版），2014，7（4）：507-510.

（收稿日期：2016-12-07）