邵明清，邵南齊

（1．臨汾市第四人民醫(yī)院，山西 臨汾041000 ；2．鄭州澍青醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450064 ）

不同載體冷凍小鼠胚胎的效果比較

邵明清1，邵南齊2

（1．臨汾市第四人民醫(yī)院，山西 臨汾041000 ；2．鄭州澍青醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450064 ）

為了比較冷凍葉片（Cryoleaf）、冷凍帽（Cryotop）、自制半麥管（hemi-straw）三種冷凍載體的凍存效果，試驗采用玻璃化冷凍方法凍存昆明小鼠8-cell胚胎。結(jié)果表明，Cryoleaf組、Cryotop組和hemi-straw組胚胎復(fù)蘇率分別為 92．3%、89．2%和 86．2%，三組比較差異不顯著(P＞0．05)。Cryoleaf組、Cryotop組及hemi-straw組胚胎的囊胚形成率分別是 95．0%、91．4%和 80．4%，三組比較差異顯著 (P＜0．05)；新鮮對照組囊胚形成率為98．5%，與Cryoleaf組、Cryotop組分別比較差異不顯著 (P＞0．05)，與自制hemi-straw組比較差異顯著(P＜0．05)。結(jié)論：采用玻璃化冷凍方法凍存小鼠8-cell期胚胎，使用Cryotop和Cryoleaf作為冷凍載體,可以獲得更高的復(fù)蘇率和囊胚率，優(yōu)于自制hemi-straw，可以很好地用來凍存人類的胚胎。

玻璃化冷凍；8-cell胚胎；小鼠；載體

近年來，玻璃化冷凍技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已成為輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域的焦點[1]。玻璃化冷凍利用含高濃度防凍劑的冷凍液，通過急速降溫，使細(xì)胞內(nèi)外的成分同時玻璃化而避免了冰晶的形成，大大提高了凍融后細(xì)胞的存活率[2]。影響胚胎凍存效果的關(guān)鍵因素是冷凍液的成分及冷凍載體.由于在冷凍液成分方面已經(jīng)有很多學(xué)者做了大量研究，目前已有商品化的冷凍解凍液套裝，由于各個實驗室的條件不同，解凍后復(fù)蘇率及囊胚率的結(jié)果相差很大。冷凍載體有很多種，現(xiàn)在國內(nèi)大多數(shù)生殖中心應(yīng)用冷凍帽(Cryotop)、冷凍葉片(Cryoleaf)和冷凍環(huán)(Cryoloop )等玻璃化冷凍載體[3]。本研究以昆明小鼠為研究對象，應(yīng)用Cryoleaf、Cryotop和自制半麥管（hemi-straw）冷凍載體開展胚胎玻璃化冷凍研究，旨在分析載體對冷凍效果的影響，進(jìn)而為人類胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的改進(jìn)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明小白鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。雌性小鼠 6～8 周齡，30只；雄性小鼠 10～12 周齡，15只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，排除應(yīng)激反應(yīng)。

1.2 藥物與試劑

孕馬血清(PMSG)，寧波第二激素廠生產(chǎn)；人絨毛膜促性腺激素(HCG)，南京動物激素廠生產(chǎn)；培養(yǎng)液（受精液FM,卵裂液CM,囊胚培養(yǎng)液BM）及礦物油由COOK公司生產(chǎn)；冷凍復(fù)蘇液、血清白蛋白代用品（HSA）由COOK公司生產(chǎn)。

1.3 耗材及儀器

培養(yǎng)皿及圓底試管由美國 Falcon公司生產(chǎn)，移液管及錐形試管由BD公司生產(chǎn)，培養(yǎng)箱由德國 Galaxy生產(chǎn)，倒置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn)，工作站由丹麥Sterile生產(chǎn)，Cryotop購于日本Kitazato，Cryoleap購于美國 Hampton，液氮貯存罐(美國MVE公司)。

2 方法

2.1 小鼠促排卵方案及胚胎的獲取[4]

取6～8周齡昆明白種雌鼠(鄭州大學(xué)實驗動物中心)于當(dāng)日13∶00 腹腔注射孕馬血清促性腺激素10 IU/只, 48 h后再腹腔注射hCG 10 IU/只,并按雌雄1∶1 合籠，次日選出見陰栓者。注射hCG 48 h后,頸椎脫臼法處死見陰栓的雌鼠, 取輸卵管, 用針劃開其壺腹部, 獲取胚胎, 置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至8-cell備用。

2.2 對第3天胚胎進(jìn)行評分

參照Racowsky的胚胎分級方法[5]將胚胎分為5級。

胚胎卵裂球數(shù)目卵裂球大小碎片Ⅰ級≥6細(xì)胞大小均勻無Ⅱ級≥6細(xì)胞大小均勻＜10%Ⅲ級＜6細(xì)胞大小不均勻＜20%Ⅳ級＜6細(xì)胞大小均勻或不均勻20%～50%Ⅴ級＜6細(xì)胞大小均勻或不均勻＞50%

Ⅰ～Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ～Ⅴ級為劣質(zhì)胚胎，選?、?、Ⅱ級胚胎進(jìn)行冷凍。

2.3 半麥管制作方法

參照 Cryotop的形狀，在冷凍麥管前端1/4處切斷，用刀片將長管頭部削成樹葉狀，再將短管部分套在樹葉狀載體上即可。

2.4 玻璃化冷凍

冷凍試劑購買商品化生產(chǎn)的加藤冷凍液 ，內(nèi)有平衡液 ES 和冷凍液 VS 兩種液體。第1步把胚胎放在ES液中平衡5 min，然后將其轉(zhuǎn)移至VS液，再把胚胎裝載在冷凍載體Cryotop、Cryoleaf和hemi-straw上，該步驟必須在1 min內(nèi)完成，要求迅速。

2.5 玻璃化解凍

復(fù)蘇試劑購買商品化生產(chǎn)的加藤解凍液，內(nèi)有4種液體，分別是TS、DS、WS1和WS2 。第一步把貯存有胚胎的載體從液氮中取出，迅速把尖端插到TS液內(nèi)，1 min 后把胚胎轉(zhuǎn)移至DS液中停留3 min，然后分別轉(zhuǎn)移至WS1和WS2中停留5 min ，再將其轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液液滴中培養(yǎng) 。

2.6 胚胎培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的胚胎用囊胚培養(yǎng)液清洗3遍，轉(zhuǎn)移到囊胚培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) ，觀察囊胚的形成情況。 同時，觀察未冷凍的對照組鼠胚發(fā)育情況，記下相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

表1 不同冷凍載體玻璃化冷凍效果的比較

如表1所示：在復(fù)蘇率方面，Cryoleaf組為92.3%，Cryotop為 89.2%，hemi-straw組為86.2%，三組之間比較差異不顯著(P>0.05) ；在囊胚形成率方面，Cryoleaf組為95.0% 與Cryotop組91.4%比較差異不顯著(P>0.05)，與hemi-straw組比較差異顯著 (P<0.05)；新鮮對照組囊胚形成率為98.5%，與Cryoleaf組、Cryotop組比較差異不顯著(P>0.05)，與自制hemi-straw組比較差異顯著(P<0.05)。

4 討論

玻璃化冷凍使胚胎避免了冷凍損傷和冰晶形成[6，7]，達(dá)到最佳冷凍保存的效果。本研究應(yīng)用Cryoleaf、Cryotop、hemi-straw三種冷凍載體，通過玻璃化冷凍方法凍融昆明小鼠8-cell期胚胎，結(jié)果提示，3組復(fù)蘇率在86.2%～92.3%，與文獻(xiàn)報道相一致[8，9]。自制hemi-straw組的囊胚形成率與新鮮對照組相比差異顯著，其余兩組與新鮮對照組比較差異不顯著。 原因可能為自制hemi-straw管壁較厚，在冷凍時接觸液氮降溫速率要慢些，這可能導(dǎo)致胚胎的不可逆冷凍損傷，而使胚胎的發(fā)育潛能在一定程度上受到損害[10]。Cryoleaf是一種由葉片、硬柄及外套管組成的冷凍載體,冷凍時將胚胎置于葉片上，套上外套管后投入液氮。其優(yōu)點是裝管方便，在投入液氮之前就可以很直觀地裝管，且避免了胚胎直接與液氮接觸，阻止了在冷凍過程中液氮里面可能存在的各種病原體對胚胎的潛在感染[11]。Cryotop法是在2005年由kuwayama提出的通過最小化溶液體積提高冷卻速率的新方法[12]。 這種載體是將一個很薄的塑料膜窄條（長20 mm，寬0.4 mm,厚0.1 mm）連接在一個塑料柄上制成的。王海松等對比幾種載體后發(fā)現(xiàn)，Cryotop法是4種方法中最為理想的方法[13]。本研究顯示，使用Cryoleaf 和Cryotop 兩種載體冷凍胚胎凍融后的復(fù)蘇率和囊胚率差異均不顯著，表明兩種冷凍載體均可應(yīng)用于小鼠胚胎的凍存。

玻璃化冷凍降溫速率依賴于載體材料的熱傳導(dǎo)性，因此，載體方面還有很多改進(jìn)之處。根據(jù)蘇風(fēng)民等的研究發(fā)現(xiàn)，除不銹鋼外，單晶硅、鋁合金、銅、金、銀等材料都可以作為冷凍載體的基體材料，它們導(dǎo)熱系數(shù)的變化對冷凍載體總傳熱熱阻影響很小[14]。因此，前端應(yīng)該用散熱快的金屬制成，載體的持續(xù)改進(jìn)將會給細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇帶來更好的結(jié)果。

綜上所述，使用冷凍葉片和冷凍帽作為冷凍載體具有復(fù)蘇率高、囊胚形成率高的優(yōu)點，優(yōu)于自制半麥管。

5 結(jié)論

采用玻璃化冷凍方法凍存小鼠8-cell期胚胎 ，使用Cryotop和Cryoleaf作為冷凍載體,可以獲得更高的復(fù)蘇率和囊胚率，優(yōu)于自制hemistraw，可以很好地用來凍存人類的胚胎。

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Comparison of the effects of different carriers on mouse embryos

SHAO Ming-qing, SHAO Nan-qi
(1．Linfen Fourth People's Hospital, Linfen 041000; 2．Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou 450064)

To study the effects of Cryoleaf、Cryotop and hemi-straw on the survival of 8-cell embryos in Kunming mice. The Cryoleaf, Cryotop and hemi-straw were used to cryopreserve Kunming mice 8-cell embryos by vitrification. Methods 8-cell embryos were collected and randomly divided into Cryoleaf group, Cryotop group, hemi-straw group and control group. The recovery rate and blastocyst formation rate after freezing and thawing were compared. Results Cryoleaf group, Cryotop group and Hemi-straw group is 92.3%, 89.2% and 86.2% respectively. There was no significant difference between the three groups (P> 0.05) The blastocyst formation rate of fresh control group was 98.5%, which was not significantly different from that of Cryoleaf group and Cryotop group (P> 0.05). The blastocyst formation rate was 95.0%, 91.4% and 80.4% 0.05). There was significant difference compared with selfmade hemi-straw group (P <0.05). Conclusion Cryotop and Cryoleaf can be used as cryopreservation medium for cryopreservation of mouse embryos at 8-cell stage by vitrification. The higher recovery rate and blastocyst rate can be obtained, which is better than that of homemade hemi-straw. Can be well used for cryopreservation of human embryos.

vitrification; 8-cell embryos; hemi-straw; carrier

S814.3

A

1005-2739（2017）03-0011-04

2017-03-01

安徽省科研資助計劃項目（自然科學(xué)）（2006jq1128）資助

邵明清(1982-)，男，河南商丘人，碩士，實驗師，研究方向：胚胎工程。Email: shaomingqing@126．com