潘文平，康 浩，康 永

（1．荔浦師范學(xué)校, 廣西 桂林 546600；2．南寧市第一中學(xué),廣西 南寧 530012；3．西北工業(yè)大學(xué), 陜西 西安 710072）

構(gòu)筑山羊卵母細(xì)胞體外成熟體系的研究

潘文平1，康 浩2，康 永3

（1．荔浦師范學(xué)校, 廣西 桂林 546600；2．南寧市第一中學(xué),廣西 南寧 530012；3．西北工業(yè)大學(xué), 陜西 西安 710072）

通過(guò)探討不同濃度的FSH、LH及HMG對(duì)山羊的卵母細(xì)胞體外成熟體系影響因素，構(gòu)筑山羊的卵母細(xì)胞的體外成熟體系，為山羊核移植及以后的優(yōu)良育種奠定基礎(chǔ)。

卵母細(xì)胞；FSH；LH；HMG；體外成熟；山羊

卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟是一極其復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的過(guò)程。這一過(guò)程中除了mRNAs轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成外，還存在其他物質(zhì)發(fā)生降解現(xiàn)象[1]。在體外進(jìn)行卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)過(guò)程中，通常以排出第一極體來(lái)判斷其成熟性，該過(guò)程也是核成熟的標(biāo)志。除了卵母細(xì)胞的核成熟以外，其胞質(zhì)的成熟也很重要，尤其是在核移植過(guò)程中，卵母細(xì)胞胞質(zhì)的成熟性關(guān)系到供體核能否實(shí)現(xiàn)再程序化以及重構(gòu)胚能否分裂發(fā)育[2]。當(dāng)前使用的卵母細(xì)胞成熟體系并非完美無(wú)缺，卵母細(xì)胞的成熟和后續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)不能完全合成。卵母細(xì)胞體外成熟使用最廣泛、穩(wěn)定的基本培養(yǎng)基為TCM199。

激素是卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)的重要成分，尤其是促性腺激素，在成熟期起著重要作用。LH和FSH是使用頻率較高的促性腺激素[3]。卵泡刺激素(FSH)是調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的重要激素，能促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞加速有絲分裂和分泌卵泡液，使卵泡成熟排卵[4]。LH可以恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，成熟的卵泡分泌前列腺素[5]。另外，人們還通過(guò)添加一些生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子和其他添加物質(zhì)，如卵泡液、非離子型表面活性劑、副甲狀腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)、成熟分裂激活物(MAS)等物質(zhì)來(lái)提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育和成熟。

本文通過(guò)探討山羊卵母細(xì)胞在不同F(xiàn)SH、LH濃度下卵母細(xì)胞的體外成熟的效果，以期建立山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，對(duì)山羊的繁殖、育種提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為山羊的種質(zhì)資源保護(hù)給予參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山羊卵巢采集于桂林某屠宰場(chǎng)。TCM199，上海聯(lián)碩生物科技有限公司；鏈霉素、青霉素，華北制藥股份有限公司；表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白等三價(jià)因子(ITS)、尿嘧啶、透明質(zhì)酸酶，核染色劑Hochest33342、BSA、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，Sigma公司；肝素鈉，蘇州市蘇牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司；LH、FSH,寧波第二激素廠；HMG，西寶生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

倒置熒光顯微鏡：日本，OLMPUS，IX71；CO2培養(yǎng)箱：上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司MM-02470-00；體視顯微鏡：麥克奧迪 SMZ-168；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器；雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺(tái)：江蘇凈化儀器制造廠；恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；超低溫冰箱：美國(guó)，F(xiàn)ORMA SCIENTIFIC；手術(shù)器械：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1．3．1 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）的收集

從屠宰場(chǎng)剛宰殺的母羊體內(nèi)剪下卵巢，保存在加有雙抗(青霉素與鏈霉素)的30～35℃滅菌生理鹽水的保溫瓶中，4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于試驗(yàn)。用預(yù)溫30～35℃的滅菌生理鹽水清洗卵巢3遍，用剪刀進(jìn)行修剪卵巢,減去多余的脂肪和結(jié)締組織，以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。將處理好的卵巢放入盛有采卵液的平皿中，用無(wú)菌手術(shù)刀片切開卵巢表面2～6 mm大小的卵泡，使之釋放出卵泡液和COCs。用排卵針撿取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，檢出的COCs分為A，B，C 3級(jí)：A級(jí)，卵丘細(xì)胞完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；B級(jí)，卵丘細(xì)胞不完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；C級(jí)，卵母細(xì)胞裸露，或胞質(zhì)略有退化。選擇A，B 級(jí)進(jìn)行培養(yǎng)。

采卵液：TCM199 + 1%FBS +100 mg/mL肝素鈉+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL鏈霉素。

1．3．2 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟培養(yǎng)

將收集到的A、B級(jí)COCs用洗卵液清洗3～4次，然后置于預(yù)平衡2 ～3 h含1 mL成熟液的U型皿中，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃、5 % CO2飽和濕度，培養(yǎng)22～24 h。洗卵液：TCM199+2 % FBS。

收集到的卵母細(xì)胞分8組,第1組用TCM199作為空白對(duì)照組，其他7組使用不同的培養(yǎng)液進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，同一實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

對(duì)照組：TCM199；基礎(chǔ)成熟液：TCM199 + 10mg/mL BSA + 1× ITS + 50μg/mL尿嘧啶+ 2.5 mmol/L谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉+50 μg/mL EGF+1μg/mL β-E2

OM Ⅰ：基礎(chǔ)成熟液+100 μg/mL FSH+20 μg/mL LH；OM Ⅱ：基礎(chǔ)成熟液+200 μg/mL FSH+40 μg/mL LH；OM Ⅲ：基礎(chǔ)成熟液+300 μg/mL FSH+60 μg/mL LH；OM Ⅳ：基礎(chǔ)成熟液+0.05 IU/mL HMG；OM Ⅴ：基礎(chǔ)成熟液+0.1 IU/mL HMG；OM Ⅵ：基礎(chǔ)成熟液+0.15 IU/mL HMG；OM Ⅶ：基礎(chǔ)成熟液+0.2 IU/mL HMG。

1．3．3 卵母細(xì)胞體外成熟效果判斷

將成熟培養(yǎng)后的COCs放置在含有0.3%的透明質(zhì)酸酶杜氏磷酸鹽緩沖鹽水輕輕將用移液管從表面去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞。在體視顯微鏡下，以異物針撥動(dòng)卵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，觀察第1極體是否排出，或使用含有Hochest 33342的洗卵液染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察是否有發(fā)光的極體分布于卵母細(xì)胞透明帶以內(nèi)。以排出第1極體的定為成熟，否則定為不成熟。

2 結(jié)果與討論

2.1 FSH和LH對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

研究了不同濃度FSH和LH對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響。觀察COCs在體外培養(yǎng)22 h的卵丘細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有增殖現(xiàn)象（圖1）。隨著激素濃度的增加，卵丘細(xì)胞增殖速度加快，擴(kuò)散直徑增大，空白對(duì)照(圖1-A)300μg/ mL，LH>60μg/ mL時(shí)，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的直徑不再加快，表明激素對(duì)山羊卵母細(xì)胞增殖有一定的影響。同時(shí)，Imagej2x軟件是用來(lái)確定不同激素濃度下對(duì)卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞投影效果。SPSS軟件分析結(jié)果表明，無(wú)激素添加的對(duì)照組的擴(kuò)散距離與OM I、OMⅡ和 OM Ⅲ的擴(kuò)散距離有著顯著差異。而OM I、OMⅡ和OMⅢ的擴(kuò)散距離差異性不大。然而，OMⅡ卵母細(xì)胞擴(kuò)張優(yōu)于OM I和OM Ⅲ，如圖2所示。

圖1 FSH與LH對(duì)山羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體擴(kuò)散度的影響（100×）

圖2 不同F(xiàn)SH和LH激素濃度卵母細(xì)胞的擴(kuò)增距離

在山羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的FSH和LH對(duì)卵母細(xì)胞成熟率影響不同。成熟培養(yǎng)液分別加入100 μg/mL FSH和20 μg/ mL LH后，卵母細(xì)胞成熟率為57.9%，與參照組的成熟率有較大差異。成熟培養(yǎng)液分別加入200 μg/mL FSH、40 μg/mL LH的OMⅡ成熟率為68.8%，與參照組的成熟率有較大差異。添加300 μg/mL FSH和60 μg/mL LH的OM Ⅲ成熟率54.6%，與對(duì)照組差異顯著(表1)。OMⅡ的成熟率與OMⅠ和OM Ⅲ的成熟率差異顯著。結(jié)果表明，成熟液中FSH和LH濃度適中對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟有重要影響，高濃度激素對(duì)卵母細(xì)胞成熟有抑制作用。

表1 不同F(xiàn)SH和LH濃度對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.2 HMG對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

HMG（FSH∶LH≈1∶1）可以在卵母細(xì)胞成熟中取代FSH和LH激素添加。HMG可促進(jìn)卵母細(xì)胞的增殖(圖3)。經(jīng)過(guò)22 h的培養(yǎng)，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散直徑表現(xiàn)為對(duì)照組(圖3A)

圖3 HMG對(duì)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)擴(kuò)散的影響(100×)

在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的HMG，卵母細(xì)胞的成熟率不同見(jiàn)表2。

表2顯示，添加0.1 IU/mL HMG的成熟率為69.6%，與對(duì)照組差異性顯著。這表明 0.1 IU/ mL HMG添加培養(yǎng)液中有利于卵母細(xì)胞的成熟。而隨著濃度不斷增加成熟率降低，說(shuō)明過(guò)多的HMG對(duì)山羊卵母細(xì)胞的成熟有抑制作用。

表2 HMG濃度對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

3 結(jié)論

(1) 成熟液Ⅰ、成熟液Ⅱ、成熟液Ⅲ中卵母細(xì)胞成熟率在68.8%～54.6%。在成熟液Ⅰ、成熟液Ⅱ中，隨著激素濃度的增加，成熟率與濃度呈正相關(guān)。在成熟液Ⅱ、成熟液Ⅲ中，隨著激素濃度的增大，卵母細(xì)胞的成熟率有著較大差異。成熟率為(73.0～53.6)%的卵母細(xì)胞，其HMG的濃度在0.1 IU/mL～0.2 IU/mL。

(2) 隨著激素濃度的增加，成熟率下降。HMG含有1∶1的 FSH和LH，已被證明是用來(lái)代替FSH和LH的成熟培養(yǎng)山羊和牛卵母細(xì)胞。本研究比較了FSH和LH對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟的影響。結(jié)果表明，200 μg/L FSH和40 μg/L LH對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響略低于0.1 IU/mL HMG，這與其他研究結(jié)果稍微不同，可能是由于激素的不同生產(chǎn)廠家造成的。筆者認(rèn)為該差異有可能是因?yàn)榧に貋?lái)源不同引起的。

(3) 山羊卵母細(xì)胞以同樣的方式不添加激素也會(huì)獲得一定的成熟率。在成熟培養(yǎng)過(guò)程中，山羊卵母細(xì)胞第1極體的排出受FSH和LH和HMG的濃度影響較大，但濃度過(guò)高也會(huì)對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟率有抑制作用。

[ 1 ]孫曉萍, 郎俠, 楊博輝, 等． 提高山羊繁殖性能的幾種方法[J]． 畜牧與飼料科學(xué), 2010, 31(3): 91-92．

[ 2 ]Edwards R G． Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, rhesus, monkey and human ovarian oocytes[J]． Nature, 1965, 208: 349-351．

[ 3 ]武浩．小鼠、山羊交互異種核移植研究[D]． 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2004．

[ 4 ]石德順, 盧克煥． 牛卵泡液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]． 廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1994, (13): 1-5．

[ 5 ]徐建祥, 周木清, 陳小武, 等． 不同條件對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]． 黑龍江動(dòng)物繁殖, 1996, 4(2): 13-14．

S826.3

A

1005-2739（2017）03-0015-05

2017-02-15

潘文平(1983-), 女，廣西桂林人，本科，從事生物教學(xué)及新型生物材料應(yīng)用研究工作。

康永, 男，陜西富平人，博士。

E-mail：kangyong_1204@163．com