裴志勇，曹丹陽，尹巧香，高偉，趙玉生

(1.中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科；3.中國人民解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所)

·基礎(chǔ)研究·

同種異體脂肪組織來源干細(xì)胞聯(lián)合地黃低聚糖對心肌梗死小型豬心肌凋亡的影響

裴志勇1，曹丹陽1，尹巧香2，高偉3，趙玉生3

(1.中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科；3.中國人民解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所)

目的 探討同種異體脂肪組織來源干細(xì)胞(ASCs)聯(lián)合地黃低聚糖(RGOs)對心肌梗死(MI)小型豬心肌凋亡的影響。方法 球囊封堵冠狀動脈前降支制備小型豬MI模型，17頭小型豬造模成功，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：ASCs組(n=4)，RGOs組(n=4)，RGOs+ASCs組(n=4)及對照組(n=5)。造模前3天、造模后1月RGOs組及RGOs+ASCs組均飼以RGOs粗提物；造模7～10 d經(jīng)冠狀動脈移植ASCs，RGOs組及對照組均注入0.9%氯化鈉注射溶液。移植后8周檢測心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡(TUNEL法)及Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，RGOs組及RGOs+ASCs組心肌細(xì)胞凋亡均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，三組Bax的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，RGOs組及RGOs+ASCs組Bcl-2的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 ASCs聯(lián)合RGOs抑制了梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。

心肌梗死；干細(xì)胞移植；地黃；心室重構(gòu)；模型，動物

急性心肌梗死(AMI)是一種常見的心血管急癥，嚴(yán)重威脅著現(xiàn)代人的健康與壽命?，F(xiàn)行的“再灌注”治療雖然可以恢復(fù)缺血梗死區(qū)血流，但對于已經(jīng)發(fā)生壞死的心肌也無能為力；另外，“缺血再灌注損傷”還會進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞，惡化心功能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞具有自我復(fù)制以及多向分化潛能，這為缺血性心臟病的再生治療帶來了新的曙光[1]。干細(xì)胞存活、分化以及生物學(xué)效能的發(fā)揮離不開其所處微環(huán)境。MI早期梗死區(qū)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)強(qiáng)烈，營養(yǎng)物質(zhì)嚴(yán)重缺乏，這種惡劣的微環(huán)境使干細(xì)胞存活率極低，改善梗死區(qū)微環(huán)境是提高干細(xì)胞移植率的重要策略。地黃是一種最常用的滋補(bǔ)中藥，地黃低聚糖(RGOs)是地黃的主要成分之一，近年研究[2-7]發(fā)現(xiàn)，RGOs具有促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞及脂肪組織來源干細(xì)胞(ASCs)增殖、分化，抗氧化損傷，抗凋亡作用。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)[8]，RGOs可以提高ASCs移植治療小型豬MI療效，改善心功能，減輕左心室重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與RGOs促進(jìn)ASCs增殖分化，抗纖維化有關(guān)?；谝陨涎芯浚疚倪M(jìn)一步探討了ASCs聯(lián)合RGOs對梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 巴馬小香豬，月齡5～7個月，體質(zhì)量20～30 kg，由中國人民解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(軍)2007-009。

Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)，特級胎牛血清(FBS)、Dispase Ⅱ中性蛋白酶(Sigma公司)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，羊抗小鼠IgG、山羊血清、小牛清蛋白血清(中杉金橋)，小鼠抗Bcl-2 單克隆抗體(Lifespan biosciences公司)，兔抗Bax多克隆抗體(stressgen公司)，硝酸纖維素膜(Bio-Rad公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)。二氧化碳孵箱(Thermo scientific公司)，低溫離心機(jī)(Sigma 3K18),普通光學(xué)顯微鏡(Leica DM IL)，倒置相差顯微鏡(Olympus BX51)。動脈鞘管、冠脈指引導(dǎo)管及冠脈球囊(Cordis)，血管造影機(jī)(GE OEC9800),多導(dǎo)生理記錄儀(成都RM6240)。RGOs是以生地黃為原料加工后由解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科提純，高效液相色譜法檢測RGOs提純物中水蘇糖含量為31.15%。

1.2 方法

1.2.1 ASCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 詳見文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 動物分組及MI模型的制備 17頭小型豬成功造模、存活并完成整個實驗，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=5)、ASCs組(n=4)、RGOs組(n=4)及RGOs+ASCs聯(lián)合組(n=4)。造模前3 d所有動物均飼以酒石酸美托洛爾(50 mg/d)及阿司匹林腸溶片(100 mg/d),RGOs組及聯(lián)合組同時飼以RGOs粗提物(4 g，2次/天)。小型豬MI模型制備術(shù)前處理，術(shù)中操作及術(shù)后處理詳見文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 ASCs移植 詳見文獻(xiàn)[8]。

1.2.4 心臟取材 動物麻醉、稱重，經(jīng)耳緣靜脈注入100 mg肝素鈉注射液。股動脈放血法使動物致死，開胸取出心臟，垂直左室長軸將左心室切成5～6 mm厚度的薄片，留取心肌梗死邊緣區(qū)標(biāo)本-70 ℃保存及4%多聚甲醛固定后保存。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL法) 每頭小型豬隨機(jī)留取3張梗死邊緣區(qū)切片計算心肌細(xì)胞凋亡。方法如下：①切片脫蠟、水化；②加蛋白酶K(20 μg/mL)),37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；③加3 %小牛血清清蛋白及20 %山羊血清,20 min；④加反應(yīng)液50μL，置濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h，0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；⑤重復(fù)步驟③；⑥加1∶2稀釋的HRP連結(jié)抗熒光素抗體20μL，置濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min；0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；⑦顯微鏡下觀察DAB-H2O2顯色，當(dāng)細(xì)胞核呈深棕色時自來水沖洗終斷反應(yīng)，蘇木精染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每張切片隨機(jī)選取5個非重疊視野(×400)，計數(shù)心肌細(xì)胞總數(shù)及凋亡心肌細(xì)胞數(shù)，計算凋亡率。

1.2.6 梗死邊緣區(qū)Bax、Bcl-2的表達(dá) RIPA裂解液提取各組心肌總蛋白，BCA法檢測樣品蛋白濃度。蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液按1∶4(V∶V) 混合，100 ℃加熱5 min。12 %聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)5 %脫脂奶粉室溫下封閉1 h，TTBS雜交液漂洗3次，加入一抗(Bax，1∶200；Bcl-2，1∶200)，4 ℃過夜；次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，以ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。β-actin 為內(nèi)參對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組之間比較先采用F檢驗而后進(jìn)行q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小型豬ASCs形態(tài)學(xué)觀察及ASCs表面抗原表達(dá) 詳見參考文獻(xiàn)[4]。

2.2 梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(21.02±1.83)%，(17.28±1.06)%，( 18.9±1.61)%，(12.68±1.88)%。與對照組比較，RGOs組及聯(lián)合治療組凋亡指數(shù)均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而ASCs組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；ASCs組與RGOs組凋亡指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而聯(lián)合治療組凋亡指數(shù)明顯低于單純RGOs及ASCs治療組(均P<0.01)(圖1)(F=20.1052,P=0.0000)。

與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與RGOs組比較，cP<0.01；與ASCs組比較，dP<0.01

圖1 移植后8周各組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.3 梗死邊緣區(qū)Bax、Bcl-2表達(dá) 圖2示各組Bax、Bcl-2的表達(dá)。Bax半定量分析：與假手術(shù)(Sham)組比較，對照組Bax水平明顯升高(P<0.01)；干預(yù)治療后ASCs組、RGOs組及聯(lián)合治療組Bax水平均明顯低于對照組(P<0.01，P<0.05，P<0.01)(圖3)(F=13.5858,P=0.0005)。Bcl-2半定量分析：與假手術(shù)(Sham)組比較，對照組Bcl-2水平明顯降低(P<0.01)，干預(yù)治療后RGOs組、聯(lián)合治療組Bcl-2的水平均明顯高于對照組(均P<0.01)；而ASCs組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)(F=34.1665,P=0.0000)。

sham：假手術(shù)組

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與對照組比較，cP<0.05；bP<0.01；sham：假手術(shù)組

圖3 各組Bax的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.01；sham：假手術(shù)組

圖4 各組Bcl-2的表達(dá)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡受多條信號通路調(diào)控，如線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及死亡受體通路。各種引起細(xì)胞凋亡的因素均可以破壞線粒體膜，使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道開放，線粒體跨膜壓下降及通透性增加，激活胞漿內(nèi)的caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族在調(diào)節(jié)線粒體通透性及細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。根據(jù)Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的生物效應(yīng)不同可分為以下兩類，①促凋亡蛋白：如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim、Bik、Bok、Puma等；②抗凋亡蛋白：如Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl、Mcl-1等；其中，Bax與Bcl-2之間的平衡在細(xì)胞是否發(fā)生凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。

RGOs是從地黃中提取的低分子量多糖成分，藥理研究表明，地黃多糖對于正常及病理動物具有較好的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)造血等作用[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RGOs還具有促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[2-4]，誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞及神經(jīng)樣細(xì)胞的作用[12-13]。多位學(xué)者對于地黃及其組分抗氧化、抗缺血性損傷進(jìn)行了深入研究。楊兵等[14]研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖可以降低正常動物血清丙二醛含量，增強(qiáng)血清谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注前給予梓醇處理，可以明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌壞死，改善心功能，其作用機(jī)制與降低過氧亞硝基陰離子的形成，增加蛋白激酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化和一氧化氮的生成，提高抗氧化能力，降低一氧化氮合酶表達(dá)和超氧陰離子自由基的在心肌缺血再灌注心臟中的產(chǎn)生有關(guān)。另一研究[16]發(fā)現(xiàn)，梓醇預(yù)處理后可以明顯減少星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，增加神經(jīng)元及微血管數(shù)量，使胞體和突起數(shù)目及形態(tài)趨近于正常，提示梓醇具有保護(hù)神經(jīng)血管單元、促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。程小麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地黃飲子孵育的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以明顯增加腦缺血損傷大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。彭輝[18]研究顯示，地黃多糖能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡對缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與改善抗氧化酶活性，提高Bcl-2/Bax的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)有關(guān)。

筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)[8]，ASCs聯(lián)合RGOs使小型豬心肌梗死體積明顯縮小，梗死區(qū)室壁厚度顯著增加，同時心功能進(jìn)一步改善；其可能的機(jī)制包括RGOs促微血管形成，提高ASCs存活率，促進(jìn)ASCs向心肌細(xì)胞分化，抗纖維化，改善心室重構(gòu)。基于以上研究，本研究進(jìn)一步探討了ASCs聯(lián)合RGOs對梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，單純RGOs組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯小于對照組，而聯(lián)合治療組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)又顯著低于單純RGOs組；本研究還顯示RGOs既能下調(diào)Bax的表達(dá)，又能上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，而ASCs僅能下調(diào)Bax的表達(dá)，對于Bcl-2的表達(dá)無明顯上調(diào)作用。提示RGOs具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，ASCs可能也有潛在的抗心肌細(xì)胞凋亡作用，而兩者聯(lián)合抗凋亡作用最強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，ASCs聯(lián)合RGOs可以明顯減少心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡，其可能的機(jī)制與調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。這為ASCs聯(lián)合RGOs改善MI小型豬心功能提供了新的證據(jù)。

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Effect of a combination of allogenic adipose tissue-derived stem cells and rehmannia glutinosa oligosaccharides on apoptosis of miniswine with myocardial infarction

PeiZhiyong*,CaoDanyang，YinQiaoxiang，GaoWei，ZhaoYusheng

(﹡DepartmentofGeriatricCardiology,ArmyGeneralHospitalofPLA,Beijing100700,China)

Objective To investigate the effect of a combination of allogenic adipose tissue-derived stem cells (ASCs) and Rehmannia Glutinosa Oligosaccharides (RGOs) on the apoptosis of miniswine with myocardial infarction (MI).Methods MI was induced in miniswine hearts by occlusion of the left anterior descending artery for 90 minutes.The survived animals after MI were divided into four groups and received intracoronary ASCs (ASCs,n=4) 7 to 10 days later,intracoronary saline in combination with RGOs(RGOs,n=4) ((administration crude extract of RGOs from 3 days prior to MI to one month post MI),intracoronary ASCs in combination with RGOs (ASCs+RGOs,n=4),or remained untreated (control,n=5).The apoptosis of border zone and the expression of Bcl-2 and Bax were detected eight weeks after transplantation.Results The administration of RGOs significantly inhibited cardiomyocyte apoptosis of border zone in RGOs and RGOs+ASCs groups(P<0.05 andP<0.01).The expression of Bax in ASCs，RGOs and RGOs+ASCs groups was significantly decreased (P<0.05)，and the expression of Bcl-2 in RGOs and RGOs+ASCs groups was significantly increased (P<0.01) compared to the control group.Conclusion The combination of ASCs and RGOs could reduce the apoptosis of peri-infarct myocardium.

Myocardial infarction;Stem cell transplantation;Rehmannia glutinosa；Ventricular remodeling；Models,animal

國家高科技研究發(fā)展計劃(2006AA02A105)

裴志勇，副主任醫(yī)師，Email:peizy6618222@sina.com

R542.22

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.02.018

2017-01-06)