關(guān) 毅，秦曉偉，李毅平，趙 剛

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)腫瘤外科,吉林 長春130021)

*通訊作者

靜脈注射表達(dá)白細(xì)胞介素-12的HSV-1溶瘤病毒抗腫瘤機(jī)制的研究

關(guān) 毅，秦曉偉，李毅平，趙 剛*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)腫瘤外科,吉林 長春130021)

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織公布數(shù)據(jù)顯示，2012年全球新發(fā)癌癥病人約1410萬，病死率高達(dá)60 %左右[1]。雖然目前手術(shù)技術(shù)、放化療和靶向藥物等治療手段方面均取得了顯著的進(jìn)步，但很難完全控制惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致病人治療效果不佳。基因改造增殖裂解性I型單純皰疹病毒，也叫HSV-I溶瘤病毒(onclytic HSV-I)，是目前國際上惡性腫瘤治療研究熱點(diǎn)之一。在動物模型上，HSV-I溶瘤病毒被證明對膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有明顯的治療效果[2，3]。溶瘤病毒傳統(tǒng)給藥方式是腫瘤內(nèi)直接注射，在將來臨床使用中有很大局限性。本研究的目的是通過靜脈注射方式給藥，在老鼠皮下腫瘤和腦腫瘤模型上，探討HSV-I溶瘤病毒與表達(dá)白細(xì)胞介素12(IL-12)HSV-I溶瘤病毒的抗腫瘤機(jī)制。本研究使用的第三代HSV-I溶瘤病毒T-01(G47Δ-empty)，是進(jìn)一步將第三代HSV-I溶瘤病毒G47Δ ICP6區(qū)域基因打掉894對堿基，同時(shí)將表達(dá)鼠性融合型白細(xì)胞介素-12(IL-12)基因插入到ICP6區(qū)域而得到T-mfIL12。在體外乃至體內(nèi)研究使用中，與G47Δ相比T-01的ICP6區(qū)域基因回復(fù)到野生型的幾率進(jìn)一步降低，從而安全性又得到提高[4]。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和HSV-I溶瘤病毒質(zhì)粒構(gòu)建

低免疫原性小鼠Neuro2a (neuroblastoma)腫瘤細(xì)胞和Vero細(xì)胞購自美國ATCC公司，細(xì)胞培養(yǎng)如文獻(xiàn)所述[2]，每種細(xì)胞均定期檢測，以防支原體感染。T-01(G47-empty)和T-mfIL12(表達(dá)鼠性IL-12的T-01)HSV-I溶瘤病毒質(zhì)粒構(gòu)建和增殖如文獻(xiàn)所述[4]，T-01是將第三代病毒G47Δ ICP6區(qū)域基因打掉894對堿基，同時(shí)將表達(dá)鼠性融合型IL-12基因插入到ICP6區(qū)域而得到T-mfIL12。利用Vero細(xì)胞采用空斑形成試驗(yàn)測定病毒質(zhì)粒滴度。

1.2 皮下腫瘤動物模型建立

本研究所用5周齡雌性HSV-I敏感A/J小鼠購自日本Sankyo公司。腫瘤模型建立具體方法如文獻(xiàn)所述[3]，將5×106Neuro2a腫瘤細(xì)胞懸液(0.1 ml無血清DMEM/F12)注入A/J小鼠左側(cè)肋腹部皮下，通常4天后會形成直徑5 mm左右皮下腫瘤(我們定為day0)，將小鼠隨機(jī)分為3組(n=6)，分別于day0、day2和day4實(shí)施治療，通過小鼠尾靜脈注射方式，分別將0.2 ml含有10%甘油PBS(對照組即mock組)、5×106pfu T-01和5×106pfu T-mfIL12(二者均為0.2 ml含有10%甘油PBS)注入小鼠體內(nèi)，從第1次day0治療開始，每周測量3次腫瘤體積和小鼠體重，腫瘤體積測算采用：體積(tumor volume)=長×寬×高(mm3)。當(dāng)皮下腫瘤最大徑≥24 mm時(shí)，處于人道主義終止實(shí)驗(yàn)。測量腫瘤體積同時(shí)測量小鼠體重。

1.3 腦腫瘤動物模型建立

腦腫瘤模型建立具體方法如文獻(xiàn)所述[3]，即通過立體定向方式將5×104Neuro2a腫瘤細(xì)胞懸液(5 μl無血清DMEM/F12)注入A/J小鼠右額葉內(nèi)(day0)，腫瘤細(xì)胞移植后第5、7、9天，通過尾靜脈注射將上述相同治療進(jìn)行3次。從day0開始，觀察老鼠生存期，死亡小鼠進(jìn)行解剖，確認(rèn)是否有腦腫瘤形成。1.4 尾靜脈注射后小鼠體內(nèi)臟器病毒分布測量

上述皮下腫瘤模型建立后，分別于day0、day2和day4尾靜脈注射T-01，治療結(jié)束后第1天(day5)收集皮下腫瘤、肺、肝、脾和腦(n=5)。DNA提取使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)，具體方法參考使用說明。采用real-time PCR測定病毒量(ABI Prism 7000)，引物為：primer 1:5’-GTCCCGCCGAACGCATACAT-3’；primer 2:5’-CCTCTTCGCTATTACGCCAG-3’[5]，50 μl反應(yīng)體積包括18 μl dH2O，25 μl 2 x SYBR Green PCR Master Mix，1 μl 10 μM forward primer，1 μl 10 μM reverse primer，和 5 μl樣品DNA。反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40循環(huán)。病毒檢出界限為100 pfu/mg，未治療皮下腫瘤組織混有各種濃度T-01作為定量標(biāo)準(zhǔn)。最后結(jié)果由ABI Prism 7000軟件測定

1.5 ELISA測定血清中IL-12和IFN-γ

皮下腫瘤建立后day0時(shí)三組分別靜脈注射治療1次，day1麻醉A/J小鼠，采取內(nèi)眼瞼靜脈叢血(n=3)，使用Mouse IL-12 p70 Immunoassay Kit (R&D)和Mouse IFN-γ ELISA Kit (ENDOGEN)分別測定血清中IL-12和IFN-γ含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

皮下腫瘤體積測定分析采用t-test檢驗(yàn)；腦腫瘤生存期分析采Kaplan-Meier法及Breslow-Gehan-Wilcoxon檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 靜注HSV-I溶瘤病毒明顯抑制皮下腫瘤生長

day14實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，三組A/J小鼠皮下腫瘤平均體積：T-mfIL12組僅為2 100 mm3±930 mm3，T-01組為4000 mm3±389 mm3，而對照組mock組則為6 000 mm3±354 mm3，從day7到day14，3組間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果說明HSV-I溶瘤病毒經(jīng)靜脈投藥，具有顯著抗腫瘤效果，而IL-12還可明顯增強(qiáng)治療效果(圖1)。同時(shí)小鼠體重結(jié)果顯示3組間無明顯差別(P>0.05，結(jié)果未顯示)，我們沒有觀察到3組小鼠出現(xiàn)較明顯的全身或神經(jīng)毒性等副作用。

圖1 A/J小鼠Neuro2a皮下腫瘤模型形成后(Day0)，分別于day0、day2和day4通過尾靜脈注射，分別將0.2 ml PBS(對照組即mock組)、5×106pfu T-01和T-mfIL12注入小鼠體內(nèi)。day14實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，T-01組(4000±389 mm3)皮下腫瘤體積明顯小于對照組(mock組，6000±354 mm3)，而T-mfIL12組(2100±930 mm3)又明顯小于T-01組，從day7到day14，3組間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，t-test)。

2.2 靜注T-mfIL12溶瘤病毒可明顯延長腦腫瘤小鼠生存期

T-mfIL12組(平均生存期19±6.64天)與對照組mock組(平均14±3.94天)相比明顯延長，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與T-01組(平均18±7.25天)相比生存期無明顯延長(P>0.05)，T-01組與mock組之間也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有死亡小鼠經(jīng)解剖均明確證實(shí)有腦腫瘤生長(圖2)。

2.3 靜注投藥皮下腫瘤內(nèi)溶瘤病毒含量明顯高于其他臟器

為了探討靜脈投藥溶瘤病毒在小鼠體內(nèi)臟器分布情況，在小鼠皮下腫瘤模型3次治療結(jié)束后day 5，我們利用real-time PCR對各臟器內(nèi)病毒含量進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下腫瘤內(nèi)溶瘤病毒含量最高，平均達(dá)1031pfu/mg，而肺、肝、脾、腎和腦內(nèi)病毒平均含量僅為100-300 pfu/mg左右，明顯低于皮下腫瘤內(nèi)病毒含量。

圖2 A/J小鼠腦腫瘤模型建立(day0)后，于第5、7、9天，通過尾靜脈注射HSV-1溶瘤病毒治療3次(同皮下腫瘤模型)。T-mfIL12組(■)與對照組mock組(Δ)相比生存期明顯延長(P<0.05)，但與T-01組(●)相比生存期無明顯延長(P>0.05)，T-01組與mock組之間也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

2.4 靜注T-mfIL12溶瘤病毒明顯促進(jìn)IFN-γ分泌表達(dá)

皮下腫瘤模型靜注治療1次后小鼠釆血測定發(fā)現(xiàn)，T-mfIL12組血清中IL-12表達(dá)量為518 pg/ml，而其他2組未發(fā)現(xiàn)IL-12表達(dá)。同時(shí)T-mfIL12組血清中IFN-γ表達(dá)高達(dá)3989pg/ml，T-01組中IFN-γ表達(dá)為174 pg/ml，mock組最少僅為115 pg/ml。結(jié)果說明靜脈投藥，T-mfIL12可有效分泌表達(dá)IL-12，而IL-12又可顯著促進(jìn)血清中IFN-γ表達(dá)，達(dá)到抗腫瘤目的。

3 討論

溶瘤病毒(oncolytic virus)療法，是近些年來國際上惡性腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。已應(yīng)用臨床研究的主要有I型單純皰疹病毒(HSV-1)、腺病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒和牛痘病毒等[6，7]。HSV-1與其他病毒相比，具有很多優(yōu)勢和特點(diǎn)：①能感染幾乎人類的所有細(xì)胞，宿主范圍廣；②能以較低病毒滴度感染殺死腫瘤細(xì)胞，且病毒復(fù)制周期短，僅需9到18小時(shí)便可產(chǎn)生大量子代病毒有效裂解腫瘤細(xì)胞；③與腫瘤選擇性有關(guān)的多個(gè)病毒復(fù)制非必需基因已被證明，有利于病毒載體的改造；④病毒基因組大(152Kb)，允許攜帶較長或多個(gè)外源目的基因；⑤病毒感染后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長效的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答；⑥安全性較高，病毒感染后并不整合到宿主細(xì)胞基因組中，而且已研制出多種有效抗皰疹病毒藥物；⑦HSV-1 病毒療法與現(xiàn)有放化療并不拮抗，聯(lián)合應(yīng)用還可增強(qiáng)療效[8]。

基因改造溶瘤病毒主要集中于與病毒病原性和DNA合成酶有關(guān)基因。代表性第二代HSV-I溶瘤病毒G207改造2個(gè)位點(diǎn)，一是敲除γ34.5基因，正常細(xì)胞感染HSV-I病毒后，細(xì)胞中雙鏈RNA依賴蛋白激酶(PKR)磷酸化，包含病毒的蛋白質(zhì)合成被阻斷，γ34.5基因產(chǎn)物可拮抗這種PKR磷酸化，而合成病毒蛋白質(zhì)，缺失γ34.5基因的HSV-1在正常細(xì)胞中不能復(fù)制增殖，但癌細(xì)胞本來的PKR活性低下，因此缺失γ34.5基因的HSV-1可在癌細(xì)胞中增殖。二是將lacZ插入ICP6編碼區(qū)，使病毒復(fù)制關(guān)鍵酶之一核糖核苷酸還原酶(RR)失活，HSV-1不能在正常細(xì)胞中復(fù)制，但在增殖旺盛的癌細(xì)胞中，RR活性明顯上升，可以代償提供給RR已失活的HSV-1，使其復(fù)制增殖。通過以上基因改造，HSV-I溶瘤病毒就可以特異性選擇在惡性腫瘤細(xì)胞中增殖。與只改造一處基因位點(diǎn)的第一代HSV-I溶瘤病毒相比，靶向性和安全性得到了很大的提高，因?yàn)椴《驹诩?xì)胞中復(fù)制增殖過程中回復(fù)到野生型病毒可能性大大降低。第三代溶瘤病毒G47Δ將G207的Δ47基因敲除，使感染細(xì)胞MHC-I表達(dá)明顯增高，從而使腫瘤抗原呈遞和抗腫瘤免疫性大大增加，研究證實(shí)G47Δ復(fù)制殺傷腫瘤細(xì)胞能力較G207顯著提高[2,8]。本研究使用HSV-I溶瘤病毒如前文所述由G47Δ衍生而來。

目前國內(nèi)外應(yīng)用HSV-I溶瘤病毒主要通過瘤內(nèi)注射，雖可使病毒最大限度在腫瘤細(xì)胞中增殖且不易發(fā)生擴(kuò)散，但對很多深部腫瘤如顱內(nèi)腫瘤，則存在諸多不便[9]。雖然現(xiàn)在神經(jīng)導(dǎo)航和神經(jīng)外科立體定向技術(shù)發(fā)展迅速，準(zhǔn)確性和安全性有充分的保證，但在臨床實(shí)際工作中，反復(fù)多次向顱內(nèi)、特別是深部膠質(zhì)瘤內(nèi)直接注射投藥，易引起腫瘤出血，也大大加重病人痛苦。本研究首先在小鼠皮下腫瘤模型上，探討HSV-I溶瘤病毒經(jīng)靜脈注射投藥的抗腫瘤效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-01治療組中腫瘤體積明顯小于對照組(mock)，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而且通過表達(dá)IL-12還可顯著增強(qiáng)抗腫瘤效果(T-mfIl12 vs T-01：P<0.001，圖1)。利用real-time PCR對各臟器內(nèi)病毒含量測定發(fā)現(xiàn)，皮下腫瘤內(nèi)病毒含量(平均1031 pfu/mg)明顯高于肺、肝、脾、腎和腦等臟器(平均含量僅為100-300 pfu/mg)。這說明靜脈注射方式用藥，HSV-I溶瘤病毒可到達(dá)并進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，且特異性選擇在惡性腫瘤內(nèi)大量復(fù)制增殖，進(jìn)而裂解殺傷腫瘤細(xì)胞。其次，小鼠腦腫瘤模型治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只是T-mfIL12組的生存期與對照組相比有明顯的延長(P<0.05)，T-01組與對照組比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。我們考慮有以下原因：①病毒靜注投藥可能很難通過血腦屏障；②模型建立后第5、7、9天治療3次，第11天小鼠出現(xiàn)死亡，治療開始時(shí)間可能過晚，溶瘤病毒還未充分起效。同時(shí)我們沒有發(fā)現(xiàn)因靜注溶瘤病毒出現(xiàn)小鼠體重明顯下降和神經(jīng)毒性反應(yīng)，說明病毒經(jīng)靜脈投藥安全性有保障，提示我們未來病毒靜脈注射方式投藥，可能應(yīng)用于神經(jīng)外科臨床工作中。

研究證明HSV-I溶瘤病毒可激起抗腫瘤免疫反應(yīng)，受此啟示人們將免疫治療基因插入到病毒中以增強(qiáng)抗腫瘤效果。病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖擴(kuò)增過程中，不斷分泌表達(dá)免疫因子，與普通質(zhì)粒相比目的基因表達(dá)量高出數(shù)倍至數(shù)百倍。目前臨床研究工作中IL-12被認(rèn)為是最有效的抗腫瘤因子，它可以激活NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、促進(jìn)DC成熟、抑制血管形成等[11,12]?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)和其它免疫因子，表現(xiàn)出強(qiáng)大抗腫瘤效果。本研究證實(shí)，靜脈注射表達(dá)IL-12的溶瘤病毒可有效表達(dá)IL-12，并且IL-12可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ，能顯著增強(qiáng)HSV-I的抗腫瘤效果。有研究證實(shí)靜注HSV-I溶瘤病毒可產(chǎn)生抗HSV-I抗體，我們前期研究工作證實(shí)抗HSV-I抗體可減弱靜脈注射病毒的療效，但有研究顯示提高注射病毒劑量可拮抗這種作用。

總之，我們研究證實(shí)靜脈注射HSV-I溶瘤病毒，可有效進(jìn)入腫瘤內(nèi)并裂解殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)病毒還可激起抗腫瘤免疫反應(yīng)，IL-12可顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究證實(shí)HSV-I溶瘤病毒和現(xiàn)行的放化療治療并不拮抗，聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)療效[8,13,14]。隨著研究進(jìn)一步深入，HSV-I溶瘤病毒經(jīng)靜脈注射用藥可能應(yīng)用于神經(jīng)外科治療膠質(zhì)瘤工作中，將大大拓寬其臨床使用范圍和提高應(yīng)用價(jià)值。我們相信HSV-I溶瘤病毒在治療惡性腦腫瘤工作中會有美好的發(fā)展前景。

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