宋維春,裴志勝,孫宏元,梁志鵬,李欣怡,徐云升

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞572022)

HPLC法測(cè)定纖維低聚糖的研究

宋維春,裴志勝,孫宏元,梁志鵬,李欣怡,徐云升

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞572022)

本研究運(yùn)用HPLC法,采用Inertsil NH2柱、示差折光檢測(cè)器,以乙腈-水為流動(dòng)相,探索纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的檢測(cè)條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在檢測(cè)器靈敏度為+8,流速為1 ml/min,進(jìn)樣量為10 μL條件下,適宜檢測(cè)條件是:流動(dòng)相為乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃.在該檢測(cè)條件下,峰高Y與濃度X的定量檢測(cè)方程為:纖維二糖Y=3001X-147.6;纖維三糖Y=915.9X+411.6;纖維四糖Y=1328X+10002;纖維五糖Y=2029X-1357.

HPLC法;纖維二糖;纖維三糖;纖維四糖;纖維五糖

低聚糖能選擇性地促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖,體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Bacteroides等多種腸道共生細(xì)菌也能利用低聚糖[1].纖維低聚糖是一種功能性低聚糖,有廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景,但因其不穩(wěn)定、易分解,目前國(guó)內(nèi)對(duì)其檢測(cè)研究報(bào)道甚少.張南南[2]用凝膠色譜法分離純化纖維三糖-纖維六糖、并用電噴霧電離質(zhì)譜進(jìn)行了分析檢定.

HPLC法在低聚果糖的檢測(cè)中有很多應(yīng)用[3-4],與其它方法相比是一種高效簡(jiǎn)便無(wú)損害的分析方法[5],本研究采用Inertsil NH2柱、示差折光檢測(cè)器,以乙腈-水為流動(dòng)相,探索纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的檢測(cè)條件,為纖維低聚糖的制備提供檢測(cè)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器及條件

LC-2010AHT高效液相色譜儀(島津公司);

RD-20型示差折光顯示器(島津公司);

色譜柱:Inertsil NH2柱、4.6×250 mm,5 μm；

檢測(cè)器靈敏度:+8,流速:1 ml/min,進(jìn)樣量:10 μl.

1.2 試劑

纖維二糖(99%)(Elicityl-OligoTech公司);纖維三糖(95%)(Megazyme公司);纖維四糖(95%)(Megazyme公司);纖維五糖(95%)(Megazyme公司).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品,置于1 ml容量瓶中,用移液槍移取1000 μl的蒸餾水,振蕩均勻,配成高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液;用移液槍移取300-700 μl高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,再移入700-300 μl蒸餾水,配成1000 μl低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.4 進(jìn)樣處理

用5 ml的注射器吸取待測(cè)液,過(guò)0.45 μm濾膜并注射到2 ml進(jìn)樣瓶中進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 柱溫的確定

在流動(dòng)相為乙腈:水=65:35條件下,分別采用柱溫38℃、41℃、44℃、47℃,分別測(cè)定纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1.

表1 柱溫變化對(duì)譜峰的影響

注:↑為正常峰;-為未檢出或有倒峰;空白為未實(shí)驗(yàn)

可見(jiàn),在柱溫為41℃和44℃時(shí),纖維二-五糖均有正常譜峰出現(xiàn),另從不同柱溫時(shí)的保留時(shí)間比較可知,柱溫越高,保留時(shí)間越短,組分之間的峰距變小,另外,纖維低聚糖在溫度較高時(shí)容易分解,故選擇41℃柱溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.2 流動(dòng)相的確定

采用柱溫41℃,在流動(dòng)相(乙腈:水)分別為75:25、70:30、65:35、60:40條件下,分別測(cè)定纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2.

表2 流動(dòng)相比例變化對(duì)譜峰的影響

注:↑為正常峰;-為未檢出或有倒峰;空白為未實(shí)驗(yàn)

由表2可見(jiàn),纖維四糖只有在流動(dòng)相比例為乙腈:水=65∶35條件下,才有正常譜峰出現(xiàn),故選擇流動(dòng)相為乙腈:水=65∶35進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別配制83.3 mg/ml纖維二糖溶液、100mg/ml纖維三糖溶液、17.9mg/ml纖維四糖溶液、4.9mg/ml纖維五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種溶液重復(fù)測(cè)定6次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3.

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

在柱溫41℃、流動(dòng)相比例為乙腈:水=65∶35條件下,分別測(cè)定不同濃度的纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,確定峰高Y與樣品濃度X的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4.

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)品混合檢定

將纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及葡萄糖溶液、纖維六糖溶液混合,在柱溫41℃、流動(dòng)相比例為乙腈:水=65:35條件下進(jìn)行測(cè)定,混合物的色譜圖如圖1.

圖1 纖維二-五糖混合物色譜圖

與單個(gè)樣品的譜圖對(duì)比可知, 1為纖維二糖、2為纖維三糖、3為纖維四糖、4為纖維五糖.

2.6 樣品檢測(cè)

取香蕉莖干制成粉末[6-7],用酶法[8]降解制成含纖維低聚糖的混合物,在柱溫41℃、流動(dòng)相比例為乙腈:水=65:35條件下,進(jìn)行色譜測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.

根據(jù)譜峰高度,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知,降解液中含纖維二糖31.7 mg/ml、纖維三糖84.1 mg/ml、纖維四糖11.3 mg/ml、纖維五糖8.4 mg/ml.

3 結(jié)論

(1)在檢測(cè)器靈敏度為+8、以乙腈-水為流動(dòng)相、流動(dòng)相流速為1 ml/min條件下,纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的適宜檢測(cè)條件為:流動(dòng)相乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃.

(2)在流動(dòng)相乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃條件下,峰高Y與濃度X的定量檢測(cè)方程為:纖維二糖Y=3001X-147.6;纖維三糖Y=915.9X+411.6;纖維四糖Y=1328X+10002;纖維五糖Y=2029X-1357.

[1]毛丙永.功能性低聚糖對(duì)腸道細(xì)菌的影響及機(jī)制[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2015.

[2]張南南.功能性低聚糖的分離純化和生理功能的研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2012.

[3]武媛麗,楊本鵬,蔡文偉,等.利用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)基因甘蔗中的低聚果糖[J].熱帶生物學(xué)報(bào),2011,2(2):101-106.

[4]萬(wàn)鵬,趙貞,劉春霞,等.高效液相色譜法測(cè)定調(diào)制乳中低聚果糖的含量[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2015,38(3):23-25.

[5]張麗君.低聚果糖檢測(cè)分析方法對(duì)比及優(yōu)劣性分析[J].食品工業(yè)科技,2015,36(23):395-399.

[6]陳多謀,宋維春,徐云升.香蕉莖干粉制備工藝研究[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào),2016,23(2):40-43.

[7]袁學(xué)軍,王瓊妹,方慧麗,等.靈芝孢子粉沖劑加工工藝的研究[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào),2015,22(5):56-60.

[8]徐小雄,雷鳴,邵貴銀,等.吊羅山阿寬蕉根際土壤放線菌的分離與初步鑒定[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào),2014,21(5):58-63.

(編校：李由明)

The HPLC Determination of Cello-oligosaccharides

SONG Wei-chun, PEI Zhi-sheng, SUN Hong-yuan, LIANG Zhi-peng，LI Xin-yi, XU Yun-sheng

(School of Life Science and Ecology, Hainan Tropic Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

In this paper, the HPLC-RID determination conditions of cellobiose, cellotriose, cellotetraose and cellopentaose were explored with Inertsil NH2chromatographic column.The results showed that the appropriate HPLC conditions on the determination of cello-oligosaccharides are that the mobile phase is acetonitrile/water (v/v) = 65/35; the velocity of mobile phase, 1ml/min; column temperature, 41℃; and the sensitivity of detector, +8.Correlations of peak height(Y) and concentration(X) are Y=3001X-147.6 for cellobiose, Y=915.9X+411.6 for cellotriose, Y=1328X+10002 for cellotetraose, and Y=2029X-1357 for cellopentaose.

HPLC; cellobiose;cellotriose; cellotetraose;cellopentaose

格式：宋維春,裴志勝,孫宏元,等.HPLC法測(cè)定纖維低聚糖的研究[J].海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報(bào),2017，24(2)：70-73.

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21262026)

宋維春(1965-),女,遼寧遼陽(yáng)人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院教授,碩士,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué).

徐云升(1963-),男,遼寧遼陽(yáng)人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院教授,碩士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué).

O629.1；TS20

A

2096-3122(2017) 02-0070-04

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.14