覃小麗, 王永華,鐘金鋒

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715； 2. 華南理工大學食品科學與工程學院， 廣州 510640)

油脂化學

不同反應溫度下T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應動力學研究

覃小麗1, 王永華2,鐘金鋒1

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715； 2. 華南理工大學食品科學與工程學院， 廣州 510640)

T1脂肪酶是一種新型耐熱脂肪酶，能催化油酸與甘油的酯化反應。當甘油與油酸物質(zhì)的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占總反應物質(zhì)量)、緩沖液的添加量5%(占總反應物質(zhì)量)和轉(zhuǎn)速542 r/min時，考察不同反應溫度(40、50、60℃)下T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應的動力學。結果表明，T1脂肪酶催化該酯化反應活化能為20.272 9 kJ/mol；當反應溫度較低(40℃)時遵循準一級反應；隨著反應溫度升高到較高范圍(50、60℃)，則變?yōu)闇识壏磻?/p>

T1 脂肪酶；甘油；油酸；酯化反應；動力學

T1脂肪酶來源于Geobacillussp.，是一種新型脂肪酶，在較高的反應溫度(60℃)下仍保持較高的酶活性和廣泛的底物特異性與選擇性[1-2]。近年來，對T1脂肪酶的研究主要集中在表達、分離純化和酶學性質(zhì)[2-5]等方面，而對T1脂肪酶應用于油脂改性的研究相對較少[6-8]。前期研究[6]顯示，盡管T1脂肪酶對長鏈脂肪酸(硬脂酸、油酸)的選擇性較差，但是其催化油酸與甘油的酯化反應在2 h內(nèi)達到80%左右的酯化率，顯示了其作為生物催化劑在油脂領域具有潛在應用。此外，我們前期從各反應因素(水添加量、反應溫度、甘油和油酸物質(zhì)的量比)對酯化率的影響出發(fā)，假設其遵循改進的一級反應動力學，結果表明模型計算值與實驗值呈現(xiàn)較好的線性關系(R2=0.996)[9]。但是，該研究僅討論了各反應因素對半經(jīng)驗的動力學方程系數(shù)的影響，對反應溫度與從反應機理推導的動力學方程的關系還缺乏深入研究，尤其是T1脂肪酶催化甘油與油酸酯化過程的動力學及其活化能尚未見報道，不利于后續(xù)工藝的優(yōu)化。因此，本文將進一步探索反應溫度對T1脂肪酶催化油酸與甘油的酯化反應的影響，從反應機理角度研究T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應的動力學并建立動力學模型，以期為T1脂肪酶應用于油脂改性工藝設計提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

甘油酯標準品(單油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)， Sigma-Aldrich公司；油酸(>70%，分析純)，上海精純試劑有限公司；T1脂肪酶(粗酶，含纖維素結合域)， 實驗室自制[6]；甘油、正己烷和異丙醇為色譜純，天津科密歐藥品公司。

1.1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；Waters 1525型高效液相色譜儀、Waters 2414型示差折光檢測器，Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 T1脂肪酶催化酯化反應

將甘油與油酸(物質(zhì)的量比2∶1，油酸4.3 g)添加到25 mL具塞錐形瓶中，隨后加入占總反應物質(zhì)量5%的緩沖液(0.05 mol/L Tris-HCl, pH 9.0)，充分混勻后在反應溫度下預熱后加入9.7 U/g 的T1脂肪酶，置于一定溫度的磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速542 r/min)中反應。考察反應溫度(40～70℃)對酶促酯化反應的影響。在反應過程中定時(0、1、2、3、6、9、12 h)取樣，樣品經(jīng)離心(6 950×g，10 min)后，上層(油相)用于HPLC分析。實驗結果以2次測定結果的算術平均值表示。

1.2.2 酯化產(chǎn)物的HPLC分析

樣品處理：取20 μL油相(見1.2.1)于1.5 mL色譜瓶中，用1 mL流動相溶解并充分混勻，待HPLC分析。

HPLC對產(chǎn)物分析的主要條件：Phenomenex Luna Silica色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35℃；流動相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比15∶1∶0.003)；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。通過對比標準樣品的保留時間對酶促酯化反應中各組分進行定性；各出峰組分(油酸、單油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)相對含量通過面積歸一化法進行定量。油酸酯化率(FA)按公式(1)計算：

(1)

式中：F0為反應初始時油酸的相對含量，%；Ft為反應一段時間后混合物中油酸的相對含量，%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用MicrosoftExcel2010對油酸與甘油在T1脂肪酶作用下的酯化率數(shù)據(jù)進行處理；以油酸的酯化率為指標進行反應過程分析，采用最小二乘法(Solver,MicrosoftExcel2010)進行擬合得到酯化反應動力學方程模型的參數(shù)。

2 結果與討論

2.1 動力學模型的建立

在T1脂肪酶的催化作用下，油酸與甘油的酯化反應可由下面的反應式表述。該酯化反應的反應速率可由公式(2)表示。

(2)

式中：rA為油酸的反應速率；ke為酯化反應的速率常數(shù)；CA為反應物油酸(A)的濃度；CB為反應物甘油(B)的濃度；α、β為反應級數(shù)。

(3)

假設在油酸與甘油酯化反應過程中油酸的酯化率為FA，反應體系中油酸的初始濃度為CA0，則在反應的任意時刻，油酸的濃度(CA)可用公式(4)表示。

(4)

(5)

公式(4)與公式(5)合并得到

(6)

(7)

2.2 T1脂肪酶催化油酸與甘油的酯化反應動力學方程參數(shù)的確定

圖1為不同反應溫度下油酸酯化率與反應時間的關系。從圖1中可看出，在甘油與油酸物質(zhì)的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占總反應物質(zhì)量)、緩沖液的添加量5%(占總反應物質(zhì)量)和轉(zhuǎn)速542 r/min 情況下，油酸酯化率隨著反應溫度的升高而呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。當反應溫度為60℃時，在考察的反應時間范圍內(nèi)油酸酯化率最高；而當反應溫度繼續(xù)升高到70℃時，油酸酯化率急劇降低，酯化率小于11.5%，這主要由于T1脂肪酶在此反應溫度下蛋白質(zhì)發(fā)生變性，酶活力嚴重損失。因此，不考慮反應溫度在70℃時對該酯化反應動力學參數(shù)的影響。

圖1 反應溫度對酯化反應的影響

在反應溫度40～60℃范圍內(nèi)，油酸酯化率與反應時間呈現(xiàn)一定的非線性關系[9](見圖1)。以Origin 8.0軟件作圖(反應時間t為橫坐標，油酸酯化率FA為縱坐標)，選用非線性方程(FA=a0-a1e-a2t)對數(shù)據(jù)進行擬合，得到該方程的各個系數(shù)(a0、a1、a2)，結果見表1。由表1可知，相關系數(shù)R2均在0.95以上，說明該非線性方程能較好表述不同反應溫度下油酸酯化率與反應時間的關系。

表1 不同反應溫度下油酸酯化率與反應時間擬合結果

(8)

根據(jù)擬合方程可以得到在不同反應溫度的參數(shù)，結果見表2。

表2 不同溫度下的反應級數(shù)和反應速率常數(shù)

由表2可知，該酯化反應在較低溫度(40℃)時呈現(xiàn)準一級反應；在較高溫度(50、60℃)時則呈現(xiàn)準二級反應。

2.3 T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應的活化能

(9)

圖2 lnk與1/T的關系

3 結 論

[1] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. A thermoalkaliphilic lipase ofGeobacillussp. T1 [J]. Extremophiles, 2007, 11(3): 527-535.

[2] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. High level expression of thermostable lipase fromGeobacillussp. strain T1 [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(1): 96-103.

[3] RAHMAN R N Z R A, LEOW T C, BASRI M, et al. Secretory expression of thermostable T1 lipase through bacteriocin release protein [J]. Protein Expr Purif, 2005, 40(2): 411-416.

[4] WANG Y, WEI D Q, WANG J F. Molecular dynamics studies on T1 lipase: insight into a double-flap mechanism [J]. J Chem Inf Model, 2010, 50(5): 875-878.

[5] HAGIWARA Y, MATSUMURA H, TATENO M. Functional roles of a structural element involving Na+-π interactions in the catalytic site of T1 lipase revealed by molecular dynamics simulations [J]. J Am Oil Chem Soc, 2009, 131(46): 16697-16705.

[6] QIN X L, LAN D M, ZHONG J F, et al. Fatty acid specificity of T1 lipase and its potential in acylglycerol synthesis [J]. J Sci Food Agric, 2014, 94(8): 1614-1621.

[7] QIN X L, HUANG H H, LAN D M, et al. Typoselectivity of crudeGeobacillussp. T1 lipase fused with a cellulose-binding domain and its use in the synthesis of structured lipids [J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(1): 55-62.

[8] XU Y, GUO S H, WANG W F, et al. Enzymatic hydrolysis of palm stearin to produce diacylglycerol with a highly thermostable lipase [J]. Eur J Lipid Sci Technol, 2013, 115(5): 564-570.

[9] 鐘金鋒, 覃小麗, 王永華. T1 脂肪酶催化合成甘油酯過程酯化率變化規(guī)律研究 [J]. 中國糧油學報, 2014, 29(12): 60-64.

Kinetics on T1 lipase-catalyzed esterification of oleic acid and glycerol at different temperatures

QIN Xiaoli1,WANG Yonghua2, ZHONG Jinfeng1

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

T1 lipase was a kind new thermostable lipase and it could catalyze esterification of oleic acid and glycerol. Under the conditions of molar ratio of glycerol to oleic acid 2∶1, dosage of enzyme 9.7 U/g(based on total mass of reactants) , dosage of Tris-HCl buffer 5%(based on total mass of reactants) and stirring speed 542 r/min, the kinetics of esterification of oleic acid and glycerol catalyzed with T1 lipase at different temperatures were inveastigated. The results showed that the activation energy was 20.272 9 kJ/mol. The kinetic model was pseudo-first order reaction when reaction temperature was lower (40℃), but it became pseudo-second order reaction when the reaction temperature increased to 50℃ and 60℃.

T1 lipase; glycerol; oleic acid; esterification; kinetics

2016-07-21；

2016-11-30

重慶市基礎科學與前沿技術研究專項(cstc2015jcyjA80013)；國家自然科學基金(31501446；31601430)；中國博士后科學基金(2016M602636)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(XDJK2016B034)

覃小麗(1984)，女，講師，博士，研究方向為油脂的生物酶法改性(E-mail)qinxl@swu.edu.cn。

鐘金鋒，副教授，博士(E-mail)jinfzhong@163.com。

TQ641;Q555

A

1003-7969(2017)02-0034-04