駱江龍 李 鯤 馮 旭 周華富 鄭寶石 黃柳柳 廖壽合

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，廣西南寧市 530021)

血漿WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在肺癌早期診斷中的臨床意義▲

駱江龍 李 鯤 馮 旭 周華富 鄭寶石 黃柳柳 廖壽合

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，廣西南寧市 530021)

目的 檢測(cè)肺癌患者血漿Wnt抑制因子-1(WIF-1)基因啟動(dòng)子的甲基化情況并分析其在肺癌早期診斷中的意義。方法 應(yīng)用巢式甲基化特異性PCR(nMSP)法，首先檢測(cè)肺癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，再分別檢測(cè)78例肺癌患者、40例肺良性病變患者和40例健康志愿者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果 肺癌患者血清癌胚抗原陽(yáng)性率為35.90%(28/78)，大致接近血漿標(biāo)本中WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率34.62% (27/78)。肺良性病變患者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為2.50%(1/40),健康志愿者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)未檢測(cè)出甲基化。肺癌患者血漿WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化和血清癌胚抗原二項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為(62.82%)，特異度為(90.00%)。不吸煙者WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化率低于吸煙者。結(jié)論 外周血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化有成為肺癌的新的檢測(cè)手段的可能性，并且對(duì)肺癌的初步篩查具有一定的臨床意義。

甲基化；肺癌；WIF-1基因；巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，調(diào)查顯示其發(fā)病率在各種腫瘤中已排在第一位，發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率相近。預(yù)計(jì)到2020年，在中國(guó)新增發(fā)病和死亡人數(shù)最多的癌癥仍是肺癌，且男女比例將趨于1 ∶1[1]。目前肺癌的治療手段有很多，除了常規(guī)的手術(shù)治療可起到根治的效果，其他諸如放療、化療、生物治療和中醫(yī)中藥治療等替代治療暫無(wú)法緩解病情的進(jìn)展，但是靶向治療領(lǐng)域的重大突破，也許是未來(lái)肺癌患者的福音?？墒钱?dāng)前肺癌的復(fù)發(fā)率和病死率仍然很高，主要原因是在醫(yī)院確診為肺癌的患者大部分已處于中晚期階段[1]。因此，早期診斷和早期治療在提高肺癌患者的治愈率、減少疾病死亡率及改善患者的預(yù)后等方面發(fā)揮著顯著的作用。

基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，且相關(guān)基因甲基化檢測(cè)有可能成為檢測(cè)胃癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的新的腫瘤標(biāo)志物；這對(duì)于疾病的鑒別診斷具有很好的作用[2，4]。WIF-1基因在結(jié)直腸癌、肺癌等細(xì)胞株均呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)[5-6]。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)并沒(méi)有研究報(bào)道血漿WIF-1基因在肺癌早期診斷的作用，所以，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)利用巢式甲基化特異性PCR(nMSP)法檢測(cè)肺癌、肺良性病變和健康患者血漿WIF-1基因異常甲基化，探討血漿WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)對(duì)于肺癌早期診斷的意義及肺癌WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床特征的聯(lián)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014年6月至2015 年10月期間在我院行開(kāi)胸手術(shù)治療并經(jīng)本院病理科檢測(cè)確診為肺癌的患者78例為研究對(duì)象，男57例，女21例，年齡38～82歲，中位年齡64.21歲。根據(jù)2015版WHO肺癌組織學(xué)分類(lèi)[7]，鱗癌42例，腺癌36例，惡性程度高55例，惡性程度低23例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，早期28例，晚期50例?；颊呔懦渌麗盒阅[瘤病史。同時(shí)選擇我院呼吸內(nèi)科同年住院治療的40例肺部非惡性腫瘤患者為對(duì)照組，男28例，女12例，年齡19～84歲，中位年齡60.23歲。對(duì)照組均排除肺部或其他器官的惡性腫瘤病史，其中支氣管哮喘16例，支氣管肺炎9例，支氣管擴(kuò)張5例，COPD 4例，肺結(jié)核、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、自發(fā)性氣胸、胸腔積液、炎性假瘤及肺囊腫各1例。選擇40例健康志愿者為健康組，男18例，女22例，年齡51～68歲，中位年齡61.18歲。健康組所有志愿者均為證實(shí)無(wú)惡性腫瘤及其他呼吸道疾病的體檢者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 受試者均于治療前抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，ACD抗凝，2 000 r/min離心15 min分離血漿，再以12 000 r/min離心15 min，獲得無(wú)血細(xì)胞成分的血漿，以1.5 mL試管分裝，于-80℃保存待檢測(cè)。同時(shí)調(diào)取入院常規(guī)的血清癌胚抗原結(jié)果，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)示。

1.2.2 血漿DNA提取 采用北京天根生物科技有限公司的血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒對(duì)組織標(biāo)本和血漿標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA提取，提取過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明操作。提取結(jié)果均采用紫外線(xiàn)分光光度計(jì)測(cè)定純度和含量。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 采用Qiagen公司的Epitect Bisulfite Kit試劑盒進(jìn)行基因甲基化修飾，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 巢式MSP 用于巢式MSP擴(kuò)增WIF-1基因引物序列見(jiàn)表1，由Invitrogen公司合成，PCR反應(yīng)體系為25 μL：包含10×PCR Buffer 2.5 μL(含Mg2+)，2.5 mmol/L的 dNTP 2.0 μL，LA Taq DNA聚合酶0.3 μL，10 pmol/L的外側(cè)引物各0.8 μL。具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))；靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))[9]。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 巢式甲基化PCR擴(kuò)增WIF-1基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 血漿WIF-1 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 肺癌患者血漿標(biāo)本中WIF-1 基因啟動(dòng)子甲基化所占比例為35.90%(27/78)，肺良性病變患者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化所占比例為2.50%(1/40)；健康志愿者血漿中甲基化所占比例為0%(0/40)。3組WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。nMSP電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 血漿WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)nMSP分析結(jié)果

Mar：50 bp DNA ladder marker；U：未甲基化；M：甲基化；LC：癌癥患者血漿；LN：正常對(duì)照血漿 ；P1：非甲基化陽(yáng)性對(duì)照；P2：甲基化陽(yáng)性對(duì)照；Water：空白對(duì)照

2.2 WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床資料的比較 78例患者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床資料的比較分析，不同性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型、TNM分期和分化程度間WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但是吸煙組患者WIF-1 基因異常甲基化率明顯高于不吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化測(cè)定對(duì)肺癌的診斷效果 將肺癌患者血漿WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化的測(cè)定結(jié)果與血清癌胚抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。血漿WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)和血清癌胚抗原檢測(cè)在診斷肺癌方面的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值大致相同，雖然WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)靈敏度較低，但特異度要高于血清癌胚抗原。WIF-1基因和血清癌胚抗原2項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)肺癌可明顯提高靈敏度(62.82%)，但特異度有所下降(90.00%)。見(jiàn)表3。

表2 WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床病理資料的分析(n)

表3 血漿 WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化及血清癌胚抗原的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值 (%)

3 討 論

目前大量的文獻(xiàn)報(bào)道[10]，當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)就是對(duì)于外周血中游離的腫瘤相關(guān)DNA的研究，并且這項(xiàng)研究對(duì)于惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后都具有不可低估的作用。表觀(guān)遺傳學(xué)研究表明，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島發(fā)生的異常甲基化對(duì)于惡性腫瘤的形成與發(fā)展關(guān)系密切[11]。研究和探討血漿中眾多基因的異常甲基化，對(duì)于惡性腫瘤早期診斷與鑒別診斷具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

3.1 WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 WIF-1基因定位于人染色體12ql4.3，其編碼產(chǎn)物為WIF-1蛋白，人的前列腺、肺和腦最多[12]。WIF-1蛋白最先發(fā)現(xiàn)于人的視網(wǎng)膜中，它由一個(gè)N末端信號(hào)序列，C端親水序列，一個(gè)WD區(qū)域和5個(gè)類(lèi)似于EPG(Epidermal Growth Factor)的連續(xù)結(jié)構(gòu)所構(gòu)成，是一種在進(jìn)化上相對(duì)保守的分泌型糖蛋白[15]。研究發(fā)現(xiàn)人肺癌WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過(guò)度甲基化可以導(dǎo)致細(xì)胞Wnt信號(hào)途徑呈異常激活，進(jìn)而引起WIF-1基因的轉(zhuǎn)錄沉默，最終發(fā)現(xiàn)有83%肺癌組織中WIF-1蛋白表達(dá)減少[10]。本研究顯示，肺癌患者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的靈敏度為34.62%(27/78)，特異度為97.50%(39/40)，結(jié)果與上述研究一致。

3.2 癌胚抗原的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 癌胚抗原在臨床上已經(jīng)被用于多種腫瘤的早期診斷，是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物，但是其特異性不強(qiáng)，僅僅具有一定的參考價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)癌胚抗原水平隨著分期越來(lái)越高。本研究表明，WIF-1基因啟動(dòng)子的異常甲基化與肺癌的臨床分期沒(méi)有相關(guān)性，對(duì)比Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者和Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿中WIF-1基因啟動(dòng)子的甲基化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化在肺癌的早期就發(fā)生了。這一結(jié)果也提示檢測(cè)血漿WIF-1基因的異常甲基化可作為診斷早期肺癌的一個(gè)新的手段。

3.3 肺癌患者和健康志愿者結(jié)果比較 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在78例肺癌患者異常甲基化所占比例為34.62%；40肺良性病變患者血漿中僅僅有1例檢測(cè)到異常甲基化；而健康志愿者血漿中沒(méi)有檢測(cè)出WIF-1基因的異常甲基化。這表明WIF-1基因的甲基化與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切。另外還有研究[13]表明肺癌患者的吸煙指數(shù)也與WIF-1基因的異常甲基化與有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該論斷。

3.4 聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果分析 有研究表明[14]，聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肺癌的檢出率。本實(shí)驗(yàn)綜合分析了肺癌患者的WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化及血清癌胚抗原，雖然特異度有所下降(90.00%) ，但是靈敏度卻有所提高(62.82%)，這說(shuō)明單個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)也有其不足之處，2個(gè)指標(biāo)的結(jié)合作用有利于肺癌的早期篩查。

綜上所述，WIF-1基因啟動(dòng)子的異常甲基化伴隨著肺癌的發(fā)生和發(fā)展，也是肺癌產(chǎn)生的機(jī)理在基因?qū)用娴囊环N有力解釋?zhuān)惓＜谆某霈F(xiàn)也往往表明肺癌的萌芽。采用nMSP法對(duì)WIF-1基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)雖然提高了檢測(cè)效率，但該方法也存在復(fù)雜和耗時(shí)長(zhǎng)等不利之處，有待于改善。腫瘤的早期篩查不僅僅是靠一項(xiàng)指標(biāo)就能完成的，這需要多個(gè)指標(biāo)的綜合考慮才能起到立竿見(jiàn)影的作用。今后，我們將開(kāi)展新的甲基化檢測(cè)方法在腫瘤方面的運(yùn)用，進(jìn)而使甲基化檢測(cè)成為一種常規(guī)檢測(cè)手段。

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Clinical utility of plasma WIF-1 gene promoter methylation detection in the early diagnosis of lung cancer

LUOJianglong，LIKun,FENGXu,ZHOUHuafu,ZHENGBaoshi,HUANGLiuliu,LIAOShouhe

(DepartmentofCardiothoracicSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

Objective To detect the status of Wnt inhibitory factor-1(WIF-1)promoter methylation in plasma of lung cancer patients and to evaluate its implications in the early diagnosis of lung cancer. Methods The nested methylation specific PCR(nMSP)was used to detect the level of carcinoembryonic antigen(CEA) in the serum of patients with lung cancer，then the status of WIF-1 promoter methylation in the plasma of 78 patients with lung cancer，40 patients with benign lung disease and 40 healthy volunteers was detected. Results The positive rate of CEA was 35.90%(28/78),was similar to 34.61% (27/78) of plasma WIF-1 genes promoter methylation in lung cancer patients. The positive rate of WIF-1 gene methylation in plasma of benign lung disease patients was 2.50%(1/40), The WIF-1 genes methylation in plasma was not discovered in healthy volunteers. The sensitivity of combined detection of plasma WIF-1 gene promoter methylation and serum CEA in patients with lung cancer was 62.82%, and the specificity was 90.00%. The WIF-1 gene promoter methylation rate was lower in smokers than that in non-smokers. Conclusion Plasma WIF-1 genes promoter methylation has the possibility of becoming a new tumor marker in lung cancer. The detection of WIF-1 genes promoter methylation has a certain potential value for the early diagnosis of lung cancer.

Methylation；Lung cancer；WIF-1 gene；Nested methylation specific PCR

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：1355005-3-19)

R 734.2

A

1673-6575(2017)02-0175-04

10.11864/j.issn.1673.2017.02.05

2017-01-18

2017-03-15)