袁東升

(淮安市動物疫病預(yù)防控制中心,江蘇淮安 223001)

仔豬大腸桿菌性腹瀉的快速診斷

袁東升

(淮安市動物疫病預(yù)防控制中心,江蘇淮安 223001)

仔豬大腸桿菌性腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種常見傳染病，可導(dǎo)致仔豬體生長停滯，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。本試驗(yàn)采集了一例似仔豬大腸桿菌性腹瀉的直腸病料，利用PCR方法對病料的增菌培養(yǎng)物進(jìn)行了檢測，確定了此例仔豬腹瀉與HPI＋大腸桿菌感染有關(guān)，同時(shí)也檢測到產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）。

仔豬 腹瀉 大腸桿菌 快速診斷

大腸桿菌是大腸埃希氏菌的俗稱，乃人和溫血動物腸道內(nèi)正常菌群成員之一，人和動物出生后數(shù)小時(shí)即可經(jīng)口進(jìn)入消化道后段，大量繁殖而定居，終生伴隨。大腸桿菌引起仔豬腹瀉癥狀的疾病包括黃痢、白痢、斷奶仔豬腹瀉及仔豬水腫病。

1 仔豬黃痢

黃痢是新生仔豬的一種急性致死性傳染病，又名初生仔豬大腸桿菌病，以腹瀉、排黃色液體糞便為主要特征，發(fā)病時(shí)間在出生后幾小時(shí)至5日之間，1～3日齡更為多見，多為同窩發(fā)生。非免疫豬群初次感染的發(fā)病率可達(dá)100%。第1胎母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率與死亡率較高，但在有感染史或經(jīng)免疫的豬群，發(fā)病率則低得多。

臨床癥狀為最初突然發(fā)生腹瀉，拉黃色水樣糞便，內(nèi)含凝乳小塊，肛門陰戶紅腫，迅速脫水和電解質(zhì)失衡。發(fā)病豬可在幾小時(shí)內(nèi)死亡，有的仔豬沒有出現(xiàn)腹瀉就已經(jīng)死亡。在流行較為嚴(yán)重的豬場，少量病豬可能出現(xiàn)嘔吐，加之體液向腸道的大量流入，可使體重下降30%～40%，病伴有脫水、腹肌松弛、無力、精神沉郁等癥狀，不久就死亡。

2 仔豬白痢

仔豬白痢多見于10～30日齡仔豬，尤以2～3周齡豬常發(fā)。仔豬突然發(fā)生腹瀉，排出乳白色或灰白色漿狀或糊狀的糞便，糞便具有腥臭味，病程2～3d；若不治療，一般經(jīng)過5～6d死亡或轉(zhuǎn)為慢性，以后仔豬生長發(fā)育不良，病豬若有良好的管理及適當(dāng)?shù)闹委煟话泐A(yù)后良好，但仔豬生長緩慢，飼料報(bào)酬低。病死的仔豬外表蒼白，消瘦，肛門和尾部附有污穢的帶灰白色、腥臭的糞便，腸黏膜有卡他性炎癥，結(jié)腸內(nèi)容物呈乳白色或灰白色，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹，胃內(nèi)乳汁凝結(jié)不全，并有大量的氣體，腸黏膜充血，出血。

該病的病原也是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，其黏附素和毒素等毒力因子特性以及血清型與仔豬黃痢的病原相似。在適宜的環(huán)境中，感染仔豬或隱性感染仔豬的ETEC可存活數(shù)周，被仔豬攝入而感染，不良環(huán)境衛(wèi)生（如環(huán)境溫度太低、穿舍風(fēng)、消毒不徹底）可促使該病的發(fā)生，而實(shí)行全進(jìn)全出制和干凈、溫暖、干燥的環(huán)境則可以減少本病的發(fā)生。

3 仔豬腹瀉

斷奶仔豬腹瀉多發(fā)于4～12周齡仔豬，是由產(chǎn)vero細(xì)胞毒素大腸桿菌引起的傳染性腸毒血癥，仔豬斷奶后，由于斷奶應(yīng)激，體內(nèi)母源抗體的逐漸消失，消化道內(nèi)環(huán)境的改變，以及飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)條件、環(huán)境因素的忽然改變，導(dǎo)致機(jī)體的抵抗力下降，當(dāng)易感仔豬感染病原性細(xì)菌后，細(xì)菌通過其自身的菌毛附著于小腸絨毛上，從而在小腸內(nèi)定居，并開始大量生長和繁殖，在這過程中產(chǎn)生毒素并被吸收，從而引起一系列臨床癥狀并導(dǎo)致仔豬死亡。

4 斷奶仔豬水腫病

ED是仔豬的一種腸毒血癥，由產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大腸桿菌引起，常發(fā)生于斷奶后5～14d或剛轉(zhuǎn)入育肥群的斷奶仔豬，以眼結(jié)膜、咽部、胃大彎、腸系膜等部位水腫為主要特征。感染豬群的發(fā)病率變化很大，在某些豬群可高達(dá)80%，但平均為30%～40%，死亡率為50%～90%。多表現(xiàn)為突然發(fā)病、精神沉郁、食欲減少、口流白沫、病豬靜臥、肌肉震顫、抽搐、共濟(jì)失調(diào)，某些病豬可能出現(xiàn)輕度腹瀉，但便秘更常見。

引起仔豬腹瀉的大腸桿菌通常是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。但新近發(fā)現(xiàn)的一些攜帶毒力島的大腸桿菌在動物中也具有重要的致病作用。本次試驗(yàn)對采自淮安市獸醫(yī)站動物門診部一例疑似仔豬大腸桿菌性腹瀉病料，通過PCR的方法進(jìn)行了致病性大腸桿菌的檢測。

5 典型病例

2015年12月取來某養(yǎng)豬戶一例疑似仔豬黃白痢的仔豬。就診時(shí)仔豬有腹瀉、嘔吐和氣喘癥狀；經(jīng)臨床剖解發(fā)現(xiàn)肺瘀血，水腫并有25%面積的壞死；全身淋巴結(jié)、肝都腫大并瘀血；腎有白色壞死點(diǎn)、蒼黃；腸道黏膜卡他性炎癥；脾臟瘀血，膽汁稀薄。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷豬細(xì)小、豬瘟和偽狂犬病病毒全為陰性。

6 診斷

6.1 實(shí)驗(yàn)室檢查

6.1.1 培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂（Mackonkey agar，蛋白胨20g，乳糖10g，氯化鈉5g，牛膽鹽5g，中性紅0.025g，瓊脂粉20g，加蒸餾水1000mL，pH7.3+0.2）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨2克，酵母抽提物1克，氯化鈉2g，加蒸餾水200mL，pH7.2）。

6.1.2 試劑

PCR試劑盒（包括Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer（Mg2+Free）、MgCl2）、10×loading buffer、DL-2000 Marker均購自大連寶生物工程有限公司。

6.1.3 引物

用于HPI毒力島保守基因和腸毒素ST1、ST2、LT1基因的擴(kuò)增引物，揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院成大榮老師設(shè)計(jì)，由大連寶生物工程公司合成。

用于irp2基因與LT1、ST1、ST2基因擴(kuò)增PCR引物

6.2 實(shí)驗(yàn)儀器

（1）電子天平：HAnGPINGJA2003；

（2）攪拌器：H-1微型混合器，上海彭氏實(shí)業(yè)有限公司；

（3）壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；

（4）無菌超凈臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；

（5）離心機(jī)：TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；

（6）HQ45B恒溫?fù)u床：中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；

（7）PCR擴(kuò)增儀：型號2400，美國PE公司；

（8）電泳儀：DYY-2，北京市六一儀器廠；

（9）電熱恒溫培養(yǎng)箱：HG303-4K，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；

（10）振蕩器：WH-1微型旋渦混合儀，上海滬四分析儀器廠。

6.3 實(shí)驗(yàn)方法

6.3.1 病料采集

用滅菌剪刀剪取了仔豬的3段小腸腸段，兩頭分別用棉繩結(jié)扎，放入塑料袋中，存入-20℃冰箱備用。

6.3.2 細(xì)菌的增菌培養(yǎng)

在超凈臺上，用酒精燈滅菌冷卻后的波爾環(huán)輕輕插入腹瀉仔豬直腸，蘸取直腸內(nèi)容物并在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行3區(qū)劃線，37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。挑粉紅色單個(gè)菌落再在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24h。連續(xù)純培養(yǎng)3代，得到8株細(xì)菌的純培養(yǎng)物。

6.3.3 細(xì)菌DNA模板的制備

在超凈臺上，取1.5mL滅菌指形管并在其中加入50ul水，然后挑取步驟2.2中培養(yǎng)基上細(xì)菌的純培養(yǎng)物放入其中，置100℃煮沸10min，然后迅速在-20℃下冷卻5min，最后從冰箱內(nèi)取出放進(jìn)離心機(jī)內(nèi)，12000r/min離心5min，取上清，即為DNA模板。置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.3.4 HPI＋大腸桿菌的快速PCR檢測

將irp-F，irp-R引物混合，濃度均為25μmol/L.按以下體系反應(yīng)：

（以上試劑均加入0.5mL指形管中，混合均勻）

PCR循環(huán)參數(shù)的選擇：

6.3.5 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的快速PCR檢測

將LT1、ST1、ST2引物混合，濃度均為25μmol/L.按以下體系反應(yīng)：

（以上試劑均加入0.5mL指形管中，混合均勻）

PCR循環(huán)參數(shù)的選擇：

6.3.6 PCR產(chǎn)物電泳鑒定

配制1%瓊脂糖溶液，按0.5mg/L加溴化乙錠（EB）制膠，取10μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣（加2μL 10×Loading Buffer），35V電泳0.7h，取出凝膠，紫外燈下鑒定，明膠成像系統(tǒng)拍照。

7 結(jié)果

7.1 HPI＋大腸桿菌的快速PCR檢測結(jié)果

用引物irp2-F和irp2-R對HPI+大腸桿菌進(jìn)行DNA擴(kuò)增，可擴(kuò)增到一段約280bp的片段。對8株大腸桿菌用PCR方法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，其中4株擴(kuò)增出irp2的特異性片段（圖1）。由此判斷可得出，此例仔豬大腸桿菌性腹瀉病料中含有HPI+大腸桿菌。

圖1 irp2 PCR產(chǎn)物電泳圖

7.2 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的快速PCR檢測結(jié)果

用引物L(fēng)T1-1 LT1-2、ST1-1 ST1-2、ST2-1、ST2-2對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行DNA擴(kuò)增，可預(yù)期分別擴(kuò)增到大小約282bp、183bp、360bp的片段【3】。對8株大腸桿菌使用多重PCR方法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，只檢測到3株有ST1特異性片段（圖2），其余腸毒素特異性條帶并未檢測到。由此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，此例仔豬大腸桿菌性腹瀉病料中含有ETEC。

圖2 ST1 多重PCR產(chǎn)物電泳圖

以上數(shù)據(jù)表明此例疑似仔豬大腸桿菌性腹瀉與HPI+大腸桿菌和ETEC均有關(guān)。

8 討論

預(yù)防仔豬大腸桿菌病的關(guān)鍵在于降低致病性大腸桿菌感染的機(jī)會和保證仔豬從初乳獲得足夠的被動免疫保護(hù)，可通過將產(chǎn)仔舍分開、實(shí)行全進(jìn)全出制和保持清潔、溫暖、干燥環(huán)境減少本病的發(fā)生。仔豬對致病性大腸桿菌的易感性依賴于腸內(nèi)特異抗體的存在，盡管仔豬在出生后第1周即開始產(chǎn)生主動抗體，但在出生后2—3周主要依賴母源抗體的保護(hù)。初乳中含有豐富的IgG抗體，常乳則以IgA占優(yōu)勢。

近幾十年來，國內(nèi)外對仔豬水腫病的免疫預(yù)防進(jìn)行了較為廣泛的研究，目前國內(nèi)也已從最初的藥物預(yù)防轉(zhuǎn)向疫苗預(yù)防。由于毒素在水腫病致病機(jī)理中的重要作用，因此對Stx2e免疫原性進(jìn)行了不少研究。隨著Stx2e的進(jìn)一步純化和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們又用Stx2e的類毒素作為免疫原和Stx2e。突變體進(jìn)行豬的免疫試驗(yàn)。目前我國仔豬水腫病的預(yù)防主要采用致病菌株制成的滅活疫苗。然而，傳統(tǒng)的仔豬水腫病疫苗只是以菌株的O抗原為基礎(chǔ)，并沒有考慮水腫毒素Stx2e和菌毛F18ab，故其免疫效果不好。鑒于Stx2e水腫毒素和F18ab菌毛是水腫病的重要致病因子，我們在新一代仔豬水腫病疫苗的研制中，除了考慮0139、0138、0141菌體抗原之外，還利用含水腫毒素Stx2e抗原和菌毛F18ab抗原的菌株用于制苗，是仔豬水腫病疫苗研制的一大改進(jìn)。

由此看來，仔豬大腸桿菌性腹瀉的快速診斷就顯得極其有用，通過PCR測定其特定基因（HPI中的irp2 ETEC中的ST、LT）便能得知感染的是何種大腸桿菌，對癥治療。

[1] 盧珊，任志鴻，陳凱，等.攜帶HPI毒力島的大腸桿菌的毒力基因分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（7）：639-642.

[2] 成大榮，朱善元.大腸桿菌與仔豬疾病[J].豬業(yè)科學(xué)，2008，25（8）：127.

本論文為省農(nóng)業(yè)三新工程 SXGC〔2016〕147項(xiàng)目