段榮婷+李洪濤+李紅玉+周皓+楊雪瓊+蔡樂+楊亞濱

[摘要] 目的 研究滇重樓內生真菌多樣性。 方法 本實驗對云南彌勒和臨滄野生滇重樓內生真菌進行分離，并基于16S rDNA序列分析和形態(tài)學方法進行鑒定。 結果 從兩地滇重樓中共分離得到42株內生真菌，分別歸屬于16個屬。其中彌勒滇重樓歸屬于13個屬，而臨滄滇重樓歸屬于8個屬。 結論 滇重樓內生真菌的差異性可能與宿主生存環(huán)境及分離部位的結構和成分等因素有關。

[關鍵詞] 滇重樓；內生真菌；分離；鑒定；多樣性

[中圖分類號] R939.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0012-04

Diversity research of endophytic fungi from Paris polyphylla var. yunnanensis

DUAN Rongting LI Hongtao LI Hongyu ZHOU Hao▲ YANG Xueqiong CAI Le YANG Yabin

School of Chemical Science and Technology， Yun'nan University， Yun'nan Province， Kunming 650091， China

[Abstract] Objective To investigate the diversity of endophytic fungi from Paris polyphylla var. yunnanensis. Methods The endophytic fungi were isolated from wild Paris polyphylla collected from Mile and Lincang of Yun'nan Province， and identified by 16S rDNA sequence analysis and morphological method. Results 42 strains of endophytic fungi were classified into 16 genus. Meanwhile， 13 genus and 8 genus endophytic fungi were isolated from Paris polyphylla of Mile and Lincang respectively. Conclusion It is reasonable to propose that the differences of endophytic fungi are related to different habitat， constituents and isolating positions of the host.

[Key words] Paris polyphylla var. yunnanensis； Endophytic fungi； Isolation； Identification； Diversity

滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis（Franch.）Hand.）為延齡草科（Trilliaceae）重樓屬一種多年生草本植物，主要分布在我國云南、四川、貴州等地[1]。滇重樓是名貴的藥用植物，主要以其干燥的地下根莖入藥，是中藥重樓的主要藥用種，也是云南某著名中成藥的原料藥。滇重樓根莖中含有的甾體化合物，具有止血、抗腫瘤、抗微生物和免疫調節(jié)等活性[2]。它的消耗主要依靠野生重樓，而滇重樓的自然繁殖率很低，生長周期較長。隨著滇重樓的價格上漲，人類的采挖速度遠超過其自然生長速度，使滇重樓資源面臨稀缺狀態(tài)。近年來，生物學各領域的研究學者對滇重樓這一云南特有的珍貴藥用植物資源開展了相應學科的研究[3-4]。

植物內生真菌（endophytic fungus）是指在健康宿主植物中生存并完成一定階段或全部階段生命周期，但不會引起宿主病理癥狀的微生物[5-6]。已有研究表明，滇重樓根狀莖能多年健康的在地下生存，其根狀莖中不但含有種類豐富的內生真菌[7-8]，而且這些內生真菌還能夠產生一些抗菌活性物質來抑制抵抗病原物的侵襲[9-11]。此外還發(fā)現(xiàn)，滇重樓內生真菌能產生與宿主活性成分相同或相似的甾體皂苷類化合物[12]。目前有關重樓內生菌的次生代謝產物研究還較少，對其進一步的研究將為尋找重樓有效成分提供新的來源，也將為尋找和發(fā)現(xiàn)新的藥物活性成分提供重要依據。

王茜等[8]對來自于云南嵩明、鶴慶及保山的野生滇重樓內生真菌菌群多樣性進行了深入的研究。本實驗按照根、莖、葉三個部位分別對采集自云南彌勒和臨滄的野生滇重樓內生真菌進行分離，再利用形態(tài)學鑒定和16S rDNA序列分析對分離到的內生真菌進行鑒定。探討兩地滇重樓各部位間內生真菌菌株的差異性和多樣性。同時本實驗通過對不同產地滇重樓內生真菌多樣性的分析，為進一步篩選發(fā)現(xiàn)活性菌株及其活性成分研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 滇重樓植株樣品

實驗研究的重樓植株于2015年5月分別采自云南彌勒和臨滄，均為無病蟲害的健康植株，由昆明醫(yī)科大學楊淑達副教授鑒定為滇重樓。采集后低溫保存，分別取兩地滇重樓的根、莖、葉部位進行內生真菌的分離。

1.2 內生真菌的分離

低溫保存的滇重樓植株各部位用無菌水洗凈；放入2.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒2 min，取出用無菌水沖洗3次；75%的乙醇浸泡2 min，無菌水清洗3次；各部位用無菌濾紙吸干水分，分別放入無菌培養(yǎng)皿中晾干。用無菌解剖刀將根部位切成1 cm長的小段，莖部位切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小的方塊，葉片切成0.2 cm×0.2 cm大小的片狀。處理好的各部位分別接入PDA培養(yǎng)基（含青霉素質量濃度為120 μg/L）中，每個培養(yǎng)皿內接種6塊組織，兩種滇重樓不同部位分別接15皿，放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。觀察各培養(yǎng)皿內菌株菌落形態(tài)并歸類、接種純化，已純化的菌種保藏在PDA斜面培養(yǎng)基內。

1.3 菌株鑒定

以《真菌鑒定手冊》[13]和《半知菌屬圖解》[14]為參考，對純化后的菌株進行基本的分類，包括從菌株的群體形態(tài)和個體形態(tài)進行比較，具有相似形態(tài)的菌株歸為同類。

采用CTBA法提取真菌基因組DNA。ITS擴增使用的引物為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），兩者為通用引物，由上海生工生物工程公司合成。50 μL PCR反應體系為：5 μL 5×PCR Buffer，4 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL ITS1，1 μL ITS4，0.3 μL Tap酶，1 μL DNA模板，其余用ddH2O補足，終體積為50 μL。PCR擴增條件為：預變性94℃ 4 min，變性94℃ 1 min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 1 min 30 s，循環(huán)32次，最后延伸72℃ 10 min。擴增后送昆明碩擎生物公司測序，測序結果在NCBI的GenBank數(shù)據庫中通過Blast搜索對比。以相似度最高的序列為參考，并用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 多樣性分析

運用BioXM2.2，ClustalX1.83對序列進行分析，并用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。以Kimura-2模型計算進化距離，通過鄰接法1000步重估得到的自展檢驗數(shù)值，使用TreeView輸出樹形圖。

本實驗參考王茜等[8]的方法計算分離率、Shanno-Wienner多樣性指數(shù)和相似性系數(shù)（J）來分別分析兩地滇重樓各部位的內生真菌分布情況、豐富程度、不同來源的均勻度及相似性程度。

2 結果

2.1 內生真菌的種群

對兩地滇重樓按照根、莖、葉三個部位進行內生真菌分離，從中共得到42株內生真菌，經形態(tài)學鑒定和16S rDNA分析將其鑒定為16個屬，見表1。鏈格孢屬（Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）為分離到的所有內生真菌中的優(yōu)勢菌種群，分別占菌株總數(shù)的19.05%和14.29%。根部共分離到6株內生真菌，分別歸屬于鐮刀菌屬（Fusarium）和青霉菌屬（Penicillium）。葉部共分離得到內生真菌13株，分別歸屬于5個屬，其中炭疽菌屬（Colletotrichum）和球腔菌屬（Mycosphaerella）僅在葉部分離得到。莖部分離得到內生真菌23株，分別歸屬于14個屬，其中枝孢屬（Cladosporium）、間座殼屬（Diaporthe）、亞隔孢殼屬（Didymella）、殼針孢屬（Septoria）、小鬼傘屬（Agaricus）、煙管菌屬（Bjerkandera）、栓菌屬（Trametes）、彎孢殼屬（Eutypa）和莖點霉屬（Phoma）僅在莖部出現(xiàn)，莖部內生真菌表現(xiàn)出最好的多樣性。

兩地滇重樓莖部內生真菌ITS序列與參考序列構建的N-J樹見圖1。從N-J樹可以看出兩地滇重樓莖部除了共有的內生真菌種屬還各自存在特有種屬，說明不同產地滇重樓內生真菌的種類存在一定的差異。

A：彌勒；B：臨滄

圖1 兩地滇重樓莖部內生真菌ITS序列與參考序列構建N-J樹

2.2 內生真菌的分布特征

通過分析分離率可以衡量特定樣品中內生真菌的豐富程度及其多重浸染的頻率。彌勒滇重樓和臨滄滇重樓在不同采集地、組織部位之間表現(xiàn)出明顯的差異性，其中兩地滇重樓根部的分離率相同，均為0.03。莖部的分離率彌勒的較高，為0.2。葉部分離率以臨滄的較高，為0.012。同一采集地的滇重樓不同部位的分離率也存在差異，彌勒滇重樓的莖部分離率最高，葉部分離率最低；臨滄的根部和莖部分離率相同且高于葉部。對比分離到的內生真菌種類，以鏈格孢屬真菌的分離率最高，為0.13。

2.3 內生真菌的多樣性

通過分析內生真菌Shanno-Wienner多樣性指數(shù)可以反映其豐富程度和不同來源的均勻度。根據分析結果可知，不同產地滇重樓的不同部位內生真菌存在明顯差異，其中，彌勒滇重樓莖部分離得到的內生真菌多樣性指數(shù)最高，為2.16；從滇重樓不同部位分離到的內生真菌多樣性指數(shù)相比，莖部內生真菌多樣性指數(shù)較高，為2.46；而兩地滇重樓內生真菌的多樣性指數(shù)相比，彌勒滇重樓內生真菌多樣性指數(shù)（2.26）高于臨滄（1.80）。見表2。

表2 兩地滇重樓內生真菌群落多樣性指數(shù)

注：“-”表示無內容

2.4 內生真菌的相似性

兩地滇重樓不同部位分離到的內生真菌的相似性可用相似性系數(shù)（J）表征，其中，根莖間J值為0.17，根葉間J值為0.00，莖葉間J值為0.23，各部位間的J值均在0.25以下，極不相似。兩產地相比J值為0.45，為中等不相似。結果表明不同產地、不同部位間的內生真菌組成并不相似。

3 討論

本實驗從彌勒及臨滄滇重樓植株內共分離得到42株內生真菌，分別屬于子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycotina），進一步歸屬為16個屬。不同產地滇重樓各部位分離到的內生真菌種屬存在一定差異，其中9個屬僅在莖部分離得到，2個屬僅在葉部分離得到。彌勒滇重樓內生真菌歸屬為13個屬，臨滄滇重樓歸屬為8個屬，彌勒滇重樓內生真菌種屬比臨滄滇重樓更具多樣性。結果表明，滇重樓內生真菌在不同生長環(huán)境及分離部位存在較明顯的差異性和多樣性，而且植物的生存環(huán)境和外界條件有可能影響其內生真菌的組成[15]。此外通過對相似性的分析，表明兩地滇重樓不同部位內生真菌組成不相似。

目前，對于滇重樓內生真菌的研究主要集中在塊莖部，有關根部和葉部的內生真菌的報道還較少[8]。本研究在葉部分離到特有的球腔菌屬和炭疽菌屬內生真菌，進一步豐富了滇重樓內生真菌多樣性，為滇重樓內生真菌的分布和篩選提供了科學依據。研究表明，重樓內生真菌能夠代謝活性物質，部分內生真菌還可以轉化產生宿主活性成分[12，16]。因此，研究滇重樓內生真菌的多樣性對促進滇重樓內生真菌活性物質開發(fā)、新資源利用等方面具有重要的研究價值和應用前景[17]。

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：程 銘）