于國云　于鑫銘　劉曉丹

摘要：本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增山臘梅幾丁質(zhì)酶基因，對幾丁質(zhì)酶基因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時成功構(gòu)建植物表達(dá)載體，為植物幾丁質(zhì)酶基因功能的研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山臘梅；幾丁質(zhì)酶；基因克??；植物表達(dá)載體

中圖分類號：Q344.13 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132003

幾丁質(zhì)酶不僅在植物抗真菌病害中起著重要的作用，而且在植物發(fā)育、生物固氮及抗逆等方面都發(fā)揮關(guān)鍵作用。特別是在病蟲害防治方面，采用生物技術(shù)的手段改良植物的抗病蟲害和抗逆的研究越來越多，且已取得了較為明顯的成果。目前已先后從小擬南芥、大白菜、菜豆、野生香蕉、紫花苜蓿、中國水仙等植物中克隆獲得幾丁質(zhì)酶基因。隨著人們對其作用、特性、表達(dá)調(diào)控及轉(zhuǎn)基因的深入研究，使幾丁質(zhì)酶基因成為植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中重要的研究對象及作物抗真菌病害基因工程的研究熱點(diǎn)。

鑒于幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病及抗逆方面的作用，本研究以抗病蟲害及抗逆性較強(qiáng)的山臘梅為材料，通過RT-PCR的方法首次克隆得到山臘梅中的幾丁質(zhì)酶基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步構(gòu)建植物表達(dá)載體。研究結(jié)果豐富了植物幾丁質(zhì)酶基因的研究，同時為通過植物基因工程手段提高植物的抗病蟲害及抗逆功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

植物材料：山臘梅種子購自源茂種業(yè)，土培至長出幼苗（約2個月），取幼嫩葉片，5mm水楊酸處理4h后立即用液氮固定，置-80℃冰箱備用。

植物表達(dá)載體：pGFPGUSPlus由吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院提供。

主要試劑：Trizol試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上檢索到臘梅幾丁質(zhì)酶基因（FJ749130），設(shè)計特異性引物。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳檢測，利用產(chǎn)物回收試劑盒純化目的片段。將純化的PCR產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。

1.2.2 山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的序列分析

對測序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，如幾丁質(zhì)酶基因序列同源性比對、蛋白保守域分析，進(jìn)一步使用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有植物表達(dá)載體的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，堿裂法提取質(zhì)粒載體。將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體同時用XbaI和SacI進(jìn)行酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收酶切后的目的基因和質(zhì)粒。將目的基因和酶切質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR檢測，并對陽性轉(zhuǎn)化子菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，堿法提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的克隆

以臘梅cDNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得一條約1000bp的特異條帶（圖1），進(jìn)一步進(jìn)行測序。

2.2山臘梅幾丁質(zhì)酶基因序列的生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果分析表明山臘梅幾丁質(zhì)酶基因全長為939bp，編碼312個氨基酸。蛋白分子量為32.9KD。核酸序列同源比對結(jié)果表明，山臘梅幾丁質(zhì)酶基因與已公布的臘梅幾丁質(zhì)酶基因（FJ560717及FJ749130）的同源性高達(dá)98%，與蒺藜苜蓿Medicago trtmcatula（Y10373）、馬鈴薯Solanum tuberosum（NM_001288193）、水稻Oryza sativa（XM_015788082）、辣椒Capsicumannuum（FJ596176）的同源性均為75%，與紫花苜蓿Medicago sativa（AY804254）的同源性為73%，與大麥Hordeum vulgare（AK358661）的同源性為65%。

幾丁質(zhì)酶蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明（圖2），其編碼的肽鏈具有典型的糖苷水解酶19家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中具有3個特征性的催化位點(diǎn)及6個推斷的幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；該結(jié)構(gòu)域與類溶菌酶超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域類似，推測該酶兼具溶菌酶活性。

根據(jù)幾丁質(zhì)酶核酸序列比對的結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站上檢索到11種不同植物的幾丁質(zhì)酶基因核酸序列，采用Neighbor_joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明（見圖3），山臘梅（Chimonanthus nitens Oliv.）與臘梅（Chimonanthus praecox（Linn.）Link）聚類在同一個單源分支上，親緣關(guān)系最近；其次是外圍枝的馬鈴薯、菜豆、辣椒、水稻等。與野生香蕉的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建

菌液PCR驗證陽性克隆子，進(jìn)一步提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果表明（如圖4），山臘梅幾丁質(zhì)酶基因已成功插入到表達(dá)載體pGFPGUSPlus中。

3討論

隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有越來越多的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入不同作物中。迄今為止，已對許多幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，如水稻、煙草、黃瓜、香蕉、花生、番茄、玉米等。隨著對植物幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)、修飾、作用機(jī)理及轉(zhuǎn)基因的深入研究，對幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能和生理作用更加了解，為進(jìn)一步開發(fā)和利用幾丁質(zhì)酶奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)，幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化作物的研究將更為實(shí)用化。我國對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因防治真菌等病害的應(yīng)用也將進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化，將為農(nóng)作物的防病治病、增產(chǎn)增收做出貢獻(xiàn)。