熊文?！×枞f旭　顏洪奎　何錦

摘要：云南省某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)母豬260多頭，所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月，部分仔豬出生第2天發(fā)病，主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉，拉黃色糞便，同養(yǎng)殖場(chǎng)肥豬、保育豬均表現(xiàn)正常。為診斷仔豬患病情況，為綜合防控提供支持，對(duì)該場(chǎng)送檢的3頭病仔豬進(jìn)行病理剖檢，采集組織用PCR技術(shù)進(jìn)行病原檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為1號(hào)豬豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測(cè)呈陽(yáng)性，3頭仔豬豬輪狀病毒抗原檢測(cè)呈陽(yáng)性，說明該生豬養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒的混合感染。通過對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)母豬、仔豬進(jìn)行免疫接種，發(fā)病仔豬隔離治療、加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等措施，最終控制了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染的疫情。

關(guān)鍵詞：仔豬腹瀉；豬圓環(huán)病毒2型；豬輪狀病毒；混合感染；PCR診斷

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132061

前言

豬輪狀病毒（RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus）雙股RNA病毒。豬輪狀病毒病為急性腸道傳染病，臨床上表現(xiàn)為哺乳仔豬和斷奶前、后仔豬嘔吐、腹瀉、脫水體重減輕為特征的急性腸道傳染病。該病在全世界各地豬場(chǎng)均有發(fā)生，多發(fā)生于晚秋、冬季和早春，呈地方性流行，輪狀病毒感染是斷奶前后仔豬腹瀉的重要原因，初期病豬表現(xiàn)為沉郁、食欲不振和不愿活動(dòng)，之后不久會(huì)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，糞便呈水樣或糊狀，黃白色或暗黑色，嚴(yán)重脫水、消瘦、體重減輕30%。本病癥狀的輕重受發(fā)病豬日齡、環(huán)境條件以及免疫狀況等的影響，一周齡以內(nèi)的仔豬受母源抗體的保護(hù)，不易發(fā)病，但如果缺乏有效的母源抗體保護(hù)，10日齡內(nèi)的仔豬發(fā)病癥狀嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)100%。病豬剖檢時(shí)可見豬小腸脹氣，腸內(nèi)容物呈棕黃色水樣，腸壁菲薄呈半透明狀，有時(shí)可見小腸彌漫性出血，胃中有未消化凝乳塊。

豬圓環(huán)病毒?。≒VCD）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種較難控制的病毒性傳染病，該病由豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）引發(fā)。該病不同年齡階段的豬均可感染，該病主要侵害哺乳仔豬和育肥豬及懷孕母豬。臨床表現(xiàn)為豬高熱、呼吸困難、咳嗽、腸炎，母豬表現(xiàn)為繁殖障礙等。其引起的疫病包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），增生性壞死性肺炎（PNP）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、先天性震顫及腸炎等。該病的主要病理變化為：貧血、黃疸、淋巴結(jié)異常腫脹，內(nèi)臟和外周淋巴結(jié)腫大到正常體積的3～4倍，切面為均勻的白色，肺部有灰褐色炎癥和腫脹，肝臟發(fā)暗、萎縮、腎臟水腫、脾臟輕度腫大，胰、小腸、結(jié)腸也常有腫大及壞死病變。豬圓環(huán)病毒病為免疫抑制性疾病，常引發(fā)其他病原混合感染和繼發(fā)感染。如豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟混合感染、豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細(xì)胞體混合感染等，而豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病混合感染卻不常見。

云南某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)共養(yǎng)殖母豬260多頭，所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月，發(fā)病豬死亡率不高，仔豬從出生的第2天發(fā)病，主要癥狀表現(xiàn)腹瀉，拉黃色糞便，仔豬斷奶后病情有所好轉(zhuǎn)。同養(yǎng)殖場(chǎng)大豬、保育豬均表現(xiàn)正常。

2016年9月1日，云南省某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)把3頭腹瀉仔豬送往云南農(nóng)業(yè)大學(xué)做檢測(cè)，根據(jù)腹瀉仔豬臨床癥狀、病理解剖結(jié)果、養(yǎng)殖場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)結(jié)果，最終確診該養(yǎng)殖場(chǎng)哺乳仔豬腹瀉由豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染引發(fā)，根據(jù)診斷結(jié)果養(yǎng)殖場(chǎng)立即采取防控措施，7d后病情被控制，14d后疫情完全平息，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料的來源

1.1.1病豬病料

來源于云南省某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)送檢3頭腹瀉仔豬，由實(shí)驗(yàn)室解剖并無菌采取仔豬的肺臟、腎臟、肝臟，小腸內(nèi)容物。3頭仔豬組織樣品分別編號(hào)1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)。

1.1.2試劑

RNAiso PlusTotalRNA購(gòu)自大連寶生物生物技術(shù)有限公司；Bioteke細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)至北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2臨床觀察及病理解剖

對(duì)送檢的3頭腹瀉仔豬進(jìn)行臨床癥狀觀察，并向養(yǎng)殖場(chǎng)戶主詳細(xì)了解發(fā)病情況，實(shí)驗(yàn)室剖檢3頭腹瀉仔豬，詳細(xì)記錄剖檢變化并取材保存。

1.3PCR檢測(cè)

1.3.1引物

本次檢測(cè)7個(gè)病原特異性引物均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，特異性引物片段長(zhǎng)度為：豬瘟病毒234bp、豬藍(lán)耳病毒330bp、豬圓環(huán)病毒701bp、豬偽狂犬病毒500bp、豬流行性腹瀉病毒為471bp、豬傳染性胃腸炎病毒439bp、豬輪狀病毒374bp。引物由上海生工（生物）有限公司合成。

1.3.2樣品DNA/RNA提取

用Trizol法提取樣品組織中的總RNA，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行；病毒DNA的提取按照百泰克生物技術(shù)有限公司的DNA快速提取試劑盒提取，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.3.3PCR擴(kuò)增目的片段

提取的RNA利用北京全式金公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)AE301-02）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以eDNA為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行豬瘟、藍(lán)耳、豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎及輪狀病毒PCR擴(kuò)增。提取的DNA利用北京全式金公司的試劑盒（貨號(hào)AS131-02），利用特異性引物進(jìn)行豬圓環(huán)、豬偽狂犬病毒PCR擴(kuò)增。

1.3.4目的基因片段PCR擴(kuò)增

將上述提取出來的樣品RNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄體系如下2×ES Reaction Mix（含10×RTBuffer，dNTPs）5uL，EasyScriptTMⅡRT/RIEmzyme Mix（含Rnase Inhibitor，反轉(zhuǎn)錄酶）0.5uL，下游引物1uL，模板RNA 3.5uL，反應(yīng)體系為10uL。將配制好的體系置于42℃反應(yīng)30min，之后85℃反應(yīng)5min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆?。將上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及提取出來的樣品DNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：Mix（含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq酶）12.5 uL，dH20 10.5 uL，上下游引物各0.5 uL，DNA 1 uL，總反應(yīng)體系為25 uL。PRRSV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃1 min，65℃1 min，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃5 min。PCV、RV、TGEV、PEDV擴(kuò)增反應(yīng)條件同PRRSV。

CSFV第1輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30sec，53℃45sec，72℃50sec，34個(gè)循環(huán)；72℃5min。將所得到的第1輪產(chǎn)物稀釋300倍后，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 40sec，34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在120V電壓下進(jìn)行30min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

1.4治療方法

根據(jù)診斷結(jié)果采取特異性防控措施和綜合性防控措施相結(jié)合的方法。方法如下。

1.4.1加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理

新生仔豬及時(shí)飼喂初乳，注意仔豬防寒保暖；斷奶仔豬提供全價(jià)飼料，提高抵抗力；保證畜舍內(nèi)通風(fēng)，防止飼養(yǎng)密度過大；做好衛(wèi)生消毒工作，嚴(yán)格控制人員、豬只流動(dòng)，畜舍外每天采用3%火堿進(jìn)行消毒，畜舍內(nèi)使用高效且刺激性小的消毒威等消毒液加大稀釋倍數(shù)進(jìn)行帶豬消毒。

1.4.2做好免疫接種工作

對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬進(jìn)行豬輪狀病毒弱毒苗、豬圓環(huán)病毒弱毒苗緊急免疫接種。

1.4.3發(fā)病豬的治療與處理

對(duì)于發(fā)病仔豬，采取隔離措施，并對(duì)腹瀉物污染的設(shè)備、飼料等進(jìn)行嚴(yán)格消毒；停止飼喂母乳，采用抗病毒、抗細(xì)菌藥物，防止豬圓環(huán)病毒2型引發(fā)繼發(fā)感染，并配合免疫球蛋白進(jìn)行治療，口服糖鹽水或靜脈注射10%葡萄糖鹽水和3%-5%碳酸氫鈉溶液，補(bǔ)充Vc。對(duì)于治療無效仔豬，立即撲殺，嚴(yán)格的無害化處理。

2結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀及病理解剖結(jié)果

送檢3頭仔豬表現(xiàn)現(xiàn)為精神沉郁，怕冷，體型消瘦，腹瀉嚴(yán)重，拉黃色糞便。經(jīng)養(yǎng)殖戶了解到該生豬養(yǎng)殖場(chǎng)共飼養(yǎng)母豬260多頭，所產(chǎn)仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時(shí)間已達(dá)2個(gè)多月，發(fā)病仔豬死亡率不高，仔豬從出生的第2天發(fā)病，主要癥狀表現(xiàn)腹瀉，拉黃色糞便，仔豬斷奶后病情有所好轉(zhuǎn)，同養(yǎng)殖場(chǎng)大豬、保育豬均表現(xiàn)正常。

實(shí)驗(yàn)室剖檢3頭仔豬，可見仔豬腎臟出血、腸膨氣脹腫、肺出血變白、脾臟腫大，結(jié)合腹瀉仔豬臨床癥狀、及養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病情況調(diào)查，初步懷疑仔豬感染病毒性疾病。

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果與分析

3頭仔豬樣品PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（見圖1）：1號(hào)豬組織樣品豬圓環(huán)病毒抗原檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，片段大小為701bp；1號(hào)豬、2號(hào)豬、3號(hào)豬組織樣品輪狀病毒抗原檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，片段大小為374bp；均與預(yù)期相符，其他病毒檢測(cè)結(jié)果均為為陰性；說明該生豬養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型和豬輪狀病毒的混合感染。

2.3治療結(jié)果

采取1.4所述治療措施7d后回訪，養(yǎng)殖場(chǎng)未出現(xiàn)新病例，14d后回訪，疫情已被控制，養(yǎng)殖場(chǎng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

3結(jié)果討論

臨床上豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染仔豬的案例并不常見，僅根據(jù)病豬臨床癥狀和病理變化，根本無法確診，科學(xué)的診斷必須在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。RV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以采用電鏡法、放射免疫實(shí)驗(yàn)、ELISA雙抗體夾心法和PCR病原檢測(cè)等H。PCV-2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病毒分離與鑒定、間接免疫熒光技術(shù)、免疫組化技術(shù)、PCR病原檢測(cè)等。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等突出優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病病原學(xué)檢測(cè)中越來越受歡迎，PCR技術(shù)在不斷完善與改進(jìn)，臨床已有成熟的PCR方法進(jìn)行豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒2型的檢測(cè)。此次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)正是采用PCR技術(shù)。

根據(jù)腹瀉仔豬臨床癥狀、剖檢病理變化以及實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)結(jié)果，確診為該養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）與豬輪狀病毒（RV）混合感染。該養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬腹瀉主要發(fā)生在哺乳仔豬，揭示母源抗體水平下降。此次腹瀉由豬輪狀病毒感染引發(fā)，而豬圓環(huán)病毒感染則使病情進(jìn)一步惡化。

在確定病因后，養(yǎng)殖場(chǎng)立即采取對(duì)母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬緊急免疫接種豬圓環(huán)病毒2型弱毒苗、豬輪狀病病毒弱毒疫苗，對(duì)發(fā)病仔豬進(jìn)行隔離治療以及加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等方面措施，最終控制了疫情。

4結(jié)論

該養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染疫情，通過對(duì)母豬、斷奶仔豬、哺乳仔豬進(jìn)行疫苗免疫，以及加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等措施，最終控制了疫情。