王 方

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部

B7-H1對(duì)脂多糖所致膿毒癥小鼠T細(xì)胞增殖的影響

王 方

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部

目的觀察B7-H 1對(duì)脂多糖所致膿毒癥小鼠T細(xì)胞增殖的影響。方法脂多糖刺激小鼠樹突狀細(xì)胞造膿毒癥免疫麻痹模型，使用光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和BrdU細(xì)胞增殖反應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)樹突狀細(xì)胞分化、B7-H 1表達(dá)水平及T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的情況。結(jié)果脂多糖促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，且B7-H 1表達(dá)平均熒光密度值由12.39增加到43.81，p＜0.001；然而T淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制，OD值由0.761減少為0.374，并且封閉B7-H 1后反應(yīng)活化，OD值由0.352增加到0.607，p＜0.001。結(jié)論免疫共抑制分子B7-H 1是脂多糖所致膿毒癥小鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)低下的主要誘因。

B7-H 1；脂多糖；膿毒癥；樹突狀細(xì)胞

Fund project：Henan province basic and advanced technology research project plan pro ject（152300410018）and Nanyang science and techno logy attack plan p roject（2015KJGG18）.

1.前言

膿毒癥（sepsis）是由感染和創(chuàng)傷等引起細(xì)菌等入侵誘發(fā)的全身炎性反應(yīng)和組織器官繼發(fā)性損傷的病理生理過程及臨床癥候群，病死率高，是重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit,ICU）難以攻克的醫(yī)學(xué)難題之一[1]。膿毒癥的發(fā)生與腸中血中脂多糖（lipopoiysaccharide,LPS）有密切關(guān)系[2]，并且免疫麻痹可能是參與膿毒癥致病過程的主要因素之一。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）是最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell,APC）[3]，DCs表面的B7H1（B7-homolog1）是程序性細(xì)胞死亡-1受體（programmed cell death 1,PD-1）的配體即PD-L1（programmed death-1-ligand 1），與活化T細(xì)胞受體PD-1結(jié)合后抑制T細(xì)胞反應(yīng)，呈現(xiàn)“免疫麻痹”－一種低下的炎癥反應(yīng)[4]。本研究以LPS刺激DCs建立膿毒癥免疫麻痹模型，探討B(tài)7-H1在LPS所致DCs免疫麻痹中的作用，為臨床上膿毒癥所致免疫麻痹的治療探尋潛在分子靶點(diǎn)。

2.資料與方法

2.1 主要試劑與動(dòng)物rmGM-CSF和rm IL-4購自美國(guó)Peprotech公司。流式檢測(cè)PE標(biāo)記B7-H1抗體及同型對(duì)照抗體購自美國(guó)eBioscience公司。Real-time PCR試劑購自中國(guó)大連Tarkara公司。BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購于美國(guó)Roche公司。C57BL∕6（H-2Kb）近交系小鼠，4-6周左右，雌性。購自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2 DCs的體外誘導(dǎo)和分組根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]培養(yǎng)板調(diào)整小鼠骨髓來源單核細(xì)胞密度約為1*106個(gè)∕ml，加入DCs專用培養(yǎng)基、rmGM-CSF和rm IL-4，4天后棄去懸浮細(xì)胞，得到未成熟DCs。實(shí)驗(yàn)組加入10ng∕ml LPS刺激12小時(shí)，對(duì)照組不加LPS。

2.3 DCs的分化和B7-H1表達(dá)檢測(cè)按照2.2方法常規(guī)誘導(dǎo)，4天后換新鮮培養(yǎng)液，加LPS（10ng∕m l）刺激12小時(shí)，用光學(xué)顯微鏡觀察DCs形態(tài)變化。收集計(jì)數(shù)細(xì)胞，冷PBS洗滌，B7-H1熒光抗體4℃避光孵育細(xì)胞30分鐘，洗滌重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)DCs負(fù)載抗原SIINFEKL（2μg∕m l），計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)∕100ul作為刺激細(xì)胞，其中B7-H1封閉抗體（10F.9G2）按0.5μg∕100ul，培養(yǎng)箱封閉約30分鐘。無菌取C57BL∕6小鼠脾臟，研磨離心并裂解紅細(xì)胞，調(diào)整為5×106個(gè)∕m l作為效應(yīng)細(xì)胞。按刺激細(xì)胞：效應(yīng)細(xì)胞=1：10總體積為200μl混合于96孔圓底板中，培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4天。按照BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書流程操作讀取OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法各組計(jì)量資料以均數(shù)（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。應(yīng)用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析Newman-Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 脂多糖誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞免疫麻痹Fig-1.LPStreatmentcould augmentDCs’maturation and suppress T lymphocytesproliferation.（A.LPS促進(jìn)DCs分化；B.LPS抑制T淋巴細(xì)胞活化增殖）（A.LPSpromoted DCs’polarization bymicroscopic imaging technique；B.LPS suppressed T lymphocytes proliferation by BrdU Cell Proliferation assay）

圖2 脂多糖上調(diào)B7-H1抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖Fig.2 LPStreatmentcould improve B7-H1 expression themolecularwhich played T lymphocytesproliferation suppression.（A-B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H1表達(dá)百分比和平均熒光密度值；C.BrdU細(xì)胞增殖反應(yīng)檢測(cè)封閉B7-H1后抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)OD值）（A-B.B7-H1 positive percentageandmean fluorescent intensity valuewere detected by flowcytometry；C.T lymphocytesproliferationwith B7-H 1 blocking antibodywas detected by BrdU cell proliferation assay）

3.結(jié)果

3.1 脂多糖刺激DCs分化和T細(xì)胞增殖情況。顯微鏡觀察顯示：對(duì)照組DCs細(xì)胞呈半懸浮集落式生長(zhǎng)，出現(xiàn)偽足和刺狀突起。當(dāng)加入LPS 12小時(shí)后，細(xì)胞重新貼壁，部分呈長(zhǎng)梭形、條索狀（見圖1A）。T細(xì)胞增殖反應(yīng)顯示，OVA負(fù)載組、LPS刺激OVA負(fù)載組均能明顯誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，OD值分別為0.761，0.374。但LPS刺激OVA負(fù)載組的增殖反應(yīng)水平（0.374）遠(yuǎn)低于OVA負(fù)載組（0.761），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001，單因素方差分析，見圖1B），表明LPS刺激促進(jìn)DCs的分化成熟但抑制T細(xì)胞活化增殖，建立膿毒癥免疫麻痹模型。

3.2 脂多糖上調(diào)B7-H 1抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示LPS刺激后DCs表達(dá)B7-H1蛋白的陽性細(xì)胞百分比由對(duì)照組100%增加到147%，平均熒光密度值（MFI）由對(duì)照組12.49增加到43.48，具有顯著差異（p＜0.001，t檢驗(yàn)，見圖2A-B）。BrdU細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果顯示，SIINFEKL負(fù)載組、LPS刺激SIINFEKL負(fù)載組和LPS刺激SIINFEKL負(fù)載并封閉B7-H1組均能明顯誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，OD值分別為0.801，0.352，0.607。而LPS刺激SIINFEKL負(fù)載并封閉B7H1組的增殖反應(yīng)水平（0.607）高于LPS刺激SIINFEKL負(fù)載組（0.352），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001，單因素方差分析，見圖2C）。以上結(jié)果表明LPS刺激顯著上調(diào)DCs共抑制分子B7H1抑制抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

4.討論

免疫麻痹是一種獲得性免疫缺陷狀態(tài)，涉及抗原提呈細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子、共刺激分子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫組分及整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的交互復(fù)雜作用過程。淋巴細(xì)胞亞群功能轉(zhuǎn)換是感染后免疫麻痹的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以脂多糖刺激小鼠樹突狀細(xì)胞造膿毒癥免疫麻痹模型，發(fā)現(xiàn)LPS刺激高表達(dá)B7H1的DCs抑制T淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平，呈現(xiàn)免疫麻痹狀態(tài)。免疫學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥病理?xiàng)l件下，DCs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)受到嚴(yán)重抑制。令人欣喜的是通過封閉抗體阻斷B7H 1能夠顯著提高低下的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平。

LPS是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，能刺激多種炎癥介質(zhì)釋放，不僅能夠通過TLR4促進(jìn)DCs的成熟及T細(xì)胞的活化，而且可促進(jìn)DCs介導(dǎo)的抗原交叉提呈。然而本研究發(fā)現(xiàn)LPS抑制DCs介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)引起免疫麻痹。對(duì)在細(xì)菌膿毒癥的研究中也證實(shí)，細(xì)菌及其產(chǎn)物L(fēng)PS通過TLR4-TRIF信號(hào)麻痹DCs抑制CTL反應(yīng)。因此阻斷TLR信號(hào)可以作為治療膿毒癥的有效方法之一。

B7-H1∕PD-1負(fù)性調(diào)控因子是近幾年腫瘤免疫醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。B7H1主要表達(dá)于小鼠DCs等免疫細(xì)胞上，與活化T細(xì)胞受體PD-1結(jié)合后，可通過誘導(dǎo)凋亡及阻止細(xì)胞周期而抑制T細(xì)胞反應(yīng)，在T細(xì)胞增殖抑制、凋亡或失能中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)LPS抑制DCs介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，呈現(xiàn)免疫麻痹，當(dāng)使用B7H1封閉抗體阻斷與T細(xì)胞的結(jié)合后，低下的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平升高。因此B7-H1可作為臨床上膿毒癥以及革蘭氏陰性細(xì)菌感染所致免疫麻痹治療的潛在分子靶點(diǎn)，以期改善患者預(yù)后。

[1]Hotchkiss RS,Coopersmith CM,McDunn JE,Ferguson TA. The sepsis seesaw：tilting toward immunosuppression[J].Nat.Med，2009；15：496-497.DOI：10.1038∕nm0509-496.

[2]Buras JA,Holzmann B,Sitkovsky M.Animalmodels of sepsis：setting the stage[J].Nat.Rev.Drug Discov，2005；4：854-865.DOI：10.1038∕nrd1854.

[3]Lin，M.L，Zhan，Y，Villadangos，J.A，and Lew，A.M.The cellbiology of cross-presentation and the role ofdendritic cellsubsets[J].Immunol.Cell Biol，2008；86：353-362.DOI：10.1038∕icb.2008.3.

[4]Wang，F(xiàn)，Wang，YY，Li J，etal.Increased Antigen Presentation but Impaired TCells Priming after Upregulation of Interferon-Beta Induced by Lipopolysaccharides Is Mediated by Upregulation of B7H1 and GITRL[J].PLOSONE，2014，9（8）：e105636.DOI：10.1371∕journal. pone.0105636.

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：152300410018）和南陽市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2015KJGG18）資助。