黃逸慧，黃志輝，黃敏麗(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

雷帕霉素對缺血再灌注損傷大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)層厚度的影響及其機制

黃逸慧，黃志輝，黃敏麗
(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察雷帕霉素對缺血再灌注損傷(RIRI)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)層厚度的影響，并探討其機制。方法 將65只健康成年SD大鼠隨機分為對照組5只、模型組30只和觀察組30只。模型組和觀察組采用前房灌注法制備RIRI大鼠模型，觀察組大鼠造模前2 h腹腔注射雷帕霉素(2 mg/kg)，模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。對照組不作任何處理。造模后0、2、6、12、24、48 h模型組、治療組分別處死5只大鼠，對照組5只大鼠實驗結(jié)束后處死,摘除眼球制成石蠟切片。HE染色光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)，測量視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度；用免疫組化法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中的Caspase-7、Calpain-1表達的平均光密度(AOD)。結(jié)果 模型組大鼠造模后早期視網(wǎng)膜水腫增厚，晚期各層細胞排列疏松，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少,發(fā)生空泡樣變性。觀察組大鼠視網(wǎng)膜損傷程度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞空泡變性程度均低于模型組相同時點。造模后0、2 h觀察組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度小于模型組(P均<0.05)，造模后6、12、24、48 h觀察組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度大于模型組(P均<0.05)。造模后各時點觀察組視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時點(P均<0.05)，但均高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 雷帕霉素可以減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度，其機制可能與其降低視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1表達有關。

雷帕霉素;視網(wǎng)膜；缺血再灌注損傷;半胱氨酸蛋白酶7；鈣蛋白酶1； 細胞凋亡

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)臨床常見于視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼以及影響視網(wǎng)膜血供的眼科術(shù)后患者，可導致患者視網(wǎng)膜細胞死亡、視功能不可逆性損害。國內(nèi)外研究表明，RIRI過程中存在細胞凋亡[1]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族介導的蛋白水解酶級聯(lián)反應最終導致細胞凋亡的發(fā)生，Caspase-7是一種效應凋亡蛋白酶，近期研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-7在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中扮演著重要角色[2～3]。鈣蛋白酶家族(Calpains)是一類依賴鈣離子激活的中性半胱氨酸酶, Calpain-1是其中較常見的一種。有研究表明視網(wǎng)膜RIRI過程中鈣蛋白酶激活[4～5]。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗菌、免疫抑制、調(diào)節(jié)自噬等作用，可抑制腦細胞凋亡[6，7]，但未見將雷帕霉素用于治療RIRI的報道。本研究觀察雷帕霉素對RIRI模型大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1表達的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD大鼠65只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學動物中心提供。雷帕霉素(美國Gene Operation公司)，Caspase-7單克隆抗體(英國Abcam公司)，Calpain-1單克隆抗體(美國OriGen公司)，PV-9000免疫組化試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 大鼠分組、RIRI模型建立及雷帕霉素應用方法 將大鼠隨機分為對照組5只、模型組30只和觀察組30只。模型組和觀察組均制備RIRI模型。觀察組大鼠造模前2 h腹腔注射雷帕霉素2 mg/kg，模型組腹腔注射等量的DMSO和生理鹽水。RIRI模型制作方法：以20 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，均選取右眼造模。使用鹽酸利多卡因滴眼液進行表面麻醉，復方托吡卡胺滴眼液散瞳。將連接生理鹽水輸液管的4.5號頭皮針沿顳側(cè)角鞏膜緣穿刺入大鼠右眼前房。緩慢勻速調(diào)整生理鹽水瓶液面高度，使其與大鼠實驗眼垂直距離在150 cm處,此時眼壓達110 mmHg，可觀察到球結(jié)膜及虹膜顏色迅速變白，視網(wǎng)膜水腫呈蒼白色。前房灌注加壓持續(xù)60 min后逐漸降低輸液瓶高度至大鼠眼水平?？梢娗蚪Y(jié)膜與虹膜顏色迅速恢復正常, 視網(wǎng)膜血供恢復呈橘紅色,拔出穿刺針頭[8]。對照組不作任何處理。模型組和觀察組造模后0、2、6、12、24、48 h分別用戊巴比妥鈉腹腔過量麻醉法處死大鼠，摘除右側(cè)眼球，保留視神經(jīng)2 mm?；旌瞎潭ㄒ篬9]固定24 h后，剔除晶狀體等眼球內(nèi)容物，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟，將標本前端以角膜、后端以視神經(jīng)根定位，石蠟包埋，視網(wǎng)膜全層連續(xù)切片，厚度4 μm，置于防脫載玻片上，于55 ℃恒溫箱烤片3 h備用。

1.3 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學觀察 取切片進行HE染色，倒置顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度測定 在400倍物鏡放大下,用圖像分析系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像，并以同等條件采集標尺圖像。應用Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進行測定。測量范圍在距離視乳頭200 μm處四周100 μm范圍內(nèi)，隨機選取4點測量厚度，取其平均數(shù)，每個標本取3張切片測定,將所測像素值轉(zhuǎn)化為微米數(shù)。

1.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1檢測 采用免疫組化PV-9000二步法染色。操作按試劑盒說明進行。Caspase-7與Calpain-1的一抗工作液濃度分別按1∶200和1∶500。DAB顯色，蘇木素輕度復染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，每只眼球隨機取3張切片，每張切片在相同倍數(shù)下(400×)隨機采集4個視野，用圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色產(chǎn)物進行分析，得出平均光密度值(AOD)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)比較 對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊。模型組大鼠造模后0 h視網(wǎng)膜組織水腫，其中神經(jīng)纖維層與內(nèi)叢狀層表現(xiàn)顯著，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞可見空泡樣變性;造模后2 h細胞腫脹，可見多個空泡樣變的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；造模后6 h視網(wǎng)膜水腫減輕，各細胞層排列疏松；造模后12 h，水腫已明顯減輕，神經(jīng)纖維層扁平，內(nèi)核層變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列較稀疏；造模后24 h，視網(wǎng)膜水腫基本消失，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少，細胞變性，神經(jīng)纖維層明顯變薄，內(nèi)核層排列紊亂、輕度變薄，外核層變化不明顯；造模后48 h視網(wǎng)膜內(nèi)層明顯變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有較多缺失。觀察組大鼠視網(wǎng)膜損傷程度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞空泡變性程度均低于模型組相同時點。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度見表1。造模后0、2 h觀察組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度小于模型組(P均<0.05)，造模后6、12、24、48 h觀察組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度大于模型組(P均<0.05)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD比較 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD見表1。觀察組造模后各時點視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時點(P均<0.05)，但均高于對照組(P均<0.05)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及Caspase-7、Calpain-1表達量比較

注：與對照組比較，＊P<0.05；與同時間點模型組比較，△P<0.05。

3 討論

RIRI可通過多種途徑，如細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性毒性物質(zhì)釋放、自由基氧化作用及神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪等[10,11]，引起視網(wǎng)膜細胞死亡，早期主要發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層，具有典型的細胞凋亡特征。Caspase家族是誘導細胞凋亡多條通路的集合點，在細胞凋亡的分子機制中起著關鍵作用[12]。Caspase是一類具有特異天冬氨酸酶切位點的半胱氨酸蛋白酶，正常情況下以無活性的酶原形式存在于細胞中。凋亡過程一旦觸發(fā)，Caspase通過自我活化、相互激活等多種形式，作用于特異性底物，呈現(xiàn)級聯(lián)放大效應，最終導致細胞結(jié)構(gòu)破壞、DNA斷裂損傷，引起細胞死亡。

Caspase-7是一種凋亡效應分子，位于Caspase級聯(lián)反應下游。Caspase-7與Caspase-3有53%的同源性，共同享有多個作用底物，且均能在凋亡過程中被Caspase-8、Caspase-9凋亡啟動分子激活，因此Caspase-7長期被認為只是對Caspase-3功能的一個補充。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-7與Caspase-3有著顯著的差異，兩者雖然存在部分功能重疊，但并不完全一致，面對不同的細胞類型及刺激物時，會呈現(xiàn)不同的表現(xiàn)[13,14]。Lakhani等[15]發(fā)現(xiàn)，Caspase-7基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞，相比較于Caspase-3基因敲除而言，對Fas/FasL和紫外線誘導的細胞凋亡更具有抵抗力。Hermel等[16]研究顯示，Caspase-7蛋白表達增多與神經(jīng)細胞凋亡密切相關。Choudhury等[17]動物實驗表明，小鼠視神經(jīng)擠壓模型中，敲除Caspase-7基因可以有效地保護視神經(jīng)，減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞細胞凋亡。因此，Caspase-7在細胞凋亡中具有重要意義。

細胞內(nèi)鈣離子超載在凋亡早期信號轉(zhuǎn)導與凋亡執(zhí)行中發(fā)揮重要作用[18]。Calpains是一類由鈣離子激活的中性半胱氨酸蛋白酶，參與細胞骨架重構(gòu)、胚胎發(fā)育、細胞凋亡以及細胞自噬等過程。Calpain-1是其中最具有代表性的成員之一，幾乎分布于所有的哺乳動物細胞，通常以酶原形式存在。活化后通過直接或間接與Caspases相互作用，在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。鈣蛋白酶的作用底物有許多，例如α-胞襯蛋白，促凋亡蛋白Bax、p53、pro-caspase-3、pro-caspase-12、c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及多聚ADP核糖聚合酶(PARP)等[19～21]?？梢姡珻alpains與Caspases有共同作用底物，在細胞凋亡過程中相互交錯作用。在許多細胞凋亡模型中，依賴于鈣離子的Calpain激活作用發(fā)生在Caspases上游[22,23]。Juliette G等[24]在皮質(zhì)神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，Calpain-1可以裂解并激活Caspase-7，其小片段產(chǎn)物活性程度遠高于Caspases途徑裂解Caspase-7所產(chǎn)生的活性片段。據(jù)此推測Caspase-7很有可能是鈣離子失衡的傳感器，在Calpain-1激活過程中被活化，進而引起細胞凋亡。

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，早期研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有免疫抑制作用,目前已作為免疫抑制劑在臨床使用。近年來研究表明，雷帕霉素還具有調(diào)節(jié)自噬、保護神經(jīng)細胞的作用[25,26]。自噬是真核細胞對蛋白質(zhì)等大分子和老化細胞器主動清除的一種方式，是一種自噬性程序性細胞死亡，與細胞凋亡相互作用，共同維持機體平衡。雷帕霉素通過誘導和促進細胞自噬的發(fā)生，可以減少神經(jīng)變性疾病過程中異常蛋白質(zhì)蓄積，減少神經(jīng)細胞凋亡。Pan等[27]研究表明,通過雷帕霉素增強自噬可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細胞損傷。Rubinsztein等[28]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)變性疾病及感染疾病中，可以通過誘導自噬對Calpain產(chǎn)生抑制作用從而得到改善。Okamoto等[29]通過建立小鼠視網(wǎng)膜炎模型，證實腹腔注射雷帕霉素可以改善視網(wǎng)膜炎模型中光感受器功能障礙，具有神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組再灌注后即刻(0 h)可見視網(wǎng)膜組織水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞可見空泡樣變性，再灌注后24 h時觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少、細胞層排列紊亂等明顯的視網(wǎng)膜病理改變；相同時間點觀察組在水腫程度、空泡樣變性等方面均較模型組有不同程度的改善。免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組大鼠視網(wǎng)膜可觀察到微量的Caspase-7陽性細胞和Calpain-1陽性細胞，主要位于神經(jīng)節(jié)細胞層。造模后各時點觀察組視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時點，但均高于對照組。表明觀察組預先給予雷帕霉素處理，能夠下調(diào)Caspase-7、Calpain-1表達，促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活。

綜上所述，雷帕霉素可以減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度，其機制可能與其降低Caspase-7、Calpain-1表達有關。由于RIRI后細胞凋亡機制復雜，多條信號通路相互交錯,雷帕霉素減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度的具體機制需進一步探討。

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黃敏麗(E-mail: nnhml@163.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.0110

R774

A

1002-266X(2017)11-0033-04

2016-08-15)