殷新明，朱小蘭，溫 堅(jiān)，朱 莉，談微微，劉頌平

(江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨鎮(zhèn)江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

論著·臨床研究

宮頸錐形切除術(shù)后宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)及其意義研究*

殷新明，朱小蘭，溫 堅(jiān)，朱 莉，談微微，劉頌平

(江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨鎮(zhèn)江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 探討宮頸錐形切除術(shù)后宮頸分泌物及宮頸組織中炎性因子的動(dòng)態(tài)變化及其意義。方法 選取2013-2015年在該院就診的行宮頸錐形切除術(shù)患者，術(shù)后定期采集宮頸創(chuàng)面分泌物及周圍組織，定量檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達(dá)，以術(shù)前作為對(duì)照組，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀察宮頸錐形切除術(shù)后行全子宮切除的標(biāo)本中炎性細(xì)胞的浸潤及表達(dá)。結(jié)果 宮頸組織及分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)在宮頸錐形切除術(shù)后逐漸升高，術(shù)后1～2周達(dá)到高峰，與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，之后逐漸下降。在宮頸錐形切除術(shù)后1周行全子宮切除的標(biāo)本病理顯示，炎性細(xì)胞浸潤及炎癥反應(yīng)最嚴(yán)重；其TNF-α、IL-6及HMGB1表達(dá)較術(shù)后4周明顯升高。結(jié)論 宮頸錐形切除術(shù)后1～2周時(shí)宮頸創(chuàng)面炎癥最為嚴(yán)重，應(yīng)避免在此階段行全子宮切除。

子宮頸錐形切除術(shù)后；子宮切除術(shù)；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6；高遷移率族蛋白質(zhì)類；術(shù)后感染

在宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)和子宮頸浸潤癌Ⅰa1期患者的處理過程中，宮頸錐形切除術(shù)是其診斷和治療的重要環(huán)節(jié)。接受宮頸錐形切除術(shù)的部分患者中后續(xù)需行全子宮切除術(shù)。本文連續(xù)檢測宮頸錐形切除術(shù)后宮頸組織及分泌物中腫瘤壞死因子-α (tumornecrosis factor-a，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukiw6，IL-6)、高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)表達(dá)的消長情況，為宮頸錐形切除術(shù)后行全子宮切除的手術(shù)時(shí)機(jī)及安全性提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013-2015年在本院就診的行宮頸錐形切除術(shù)患者36例。分為A組(術(shù)前)，B組(術(shù)后48 h)，C組(術(shù)后1周)，D組(術(shù)后2周)，E組(術(shù)后3周)，F(xiàn)組(術(shù)后4周)，G組(術(shù)后6周)。本研究通過本院倫理委員會(huì)審批，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 分泌物：均用一次性宮頸采樣刷刷取宮頸(術(shù)前)或?qū)m頸創(chuàng)面(術(shù)后)兩圈，將刷子放入裝有1 mL Trizol的小管中，涮20次，如陰道內(nèi)有液體取材前用棉球拭去。組織標(biāo)本：手術(shù)前活檢鉗鉗取手術(shù)野外周圍組織，手術(shù)后取創(chuàng)面外周圍組織2塊，放入裝有1 mL Trizol的小管,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)分泌物及組織總 RNA的提取。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(3)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建，采用普通PCR擴(kuò)增TNF-α、IL-6、HMGB1和β-actin基因，引物序列見表1。(4)于術(shù)前、術(shù)后48 h及術(shù)后1、2、3、4、6周分別取患者宮頸分泌物及宮頸組織，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測分泌物及組織中TNF-α、IL-6、HMGB1表達(dá)。(5)宮頸錐形切除術(shù)后行全子宮切除，HE染色下觀察炎性細(xì)胞的浸潤情況；免疫組織化學(xué)法比較宮頸錐形切除術(shù)后1周、4周行全子宮切除TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)。

表1 各引物序列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖，兩組間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)比較 術(shù)后TNF-α表達(dá)逐漸升高，術(shù)后1周最高，之后逐漸降低；A組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其余各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-6、HMGB1表達(dá)術(shù)后1周最高，A組與C組、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)比較 TNF-α表達(dá)在術(shù)后逐漸升高，術(shù)后1周最高；A組與C組、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-6表達(dá)在術(shù)后逐漸升高，術(shù)后1周最高；A組與C組、D組、E組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HMGB1表達(dá)術(shù)后2周最高，A組與C組、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

A:TNF-α；B：IL-6；C：HMGB1。

圖1 宮頸分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)

A:TNF-α；B：IL-6；C：HMGB1。

圖2 宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)

2.3 病理標(biāo)本 CINⅢ級(jí)發(fā)生于移行帶(鱗柱交界)；CINⅢ級(jí)異型的鱗狀上皮累及全層，腫瘤細(xì)胞缺乏分化，異型顯著、核漿比高及全層核分裂象可見，見圖3。炎癥反應(yīng)輕微，間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張，上皮組織全部切除，見圖4A；炎癥反應(yīng)顯著，大量中性粒細(xì)胞、淋巴、漿細(xì)胞浸潤，表面見較多炎性滲出，上皮組織完全切除(高倍)，見圖4B；炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，表面少許炎性滲出，間質(zhì)輕度水腫，見圖4C；炎癥細(xì)胞進(jìn)一步減少，間質(zhì)纖維化，見圖4D；鱗狀上皮恢復(fù)，伴少許炎性細(xì)胞浸潤，見圖4E；炎癥細(xì)胞稀少，部分區(qū)域?yàn)樾迯?fù)性鱗狀上皮覆蓋，見圖4F；間質(zhì)內(nèi)見散在炎癥細(xì)胞，出現(xiàn)成熟性修復(fù)性鱗狀上皮，見圖4G。

2.4 宮頸錐形切除術(shù)后1周、4周行全子宮切除標(biāo)本中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá) 宮頸錐形切除術(shù)后1周行全子宮切除術(shù)標(biāo)本中三者的表達(dá)均高于術(shù)后4周。見圖5。

圖3 標(biāo)本病理(×200)

A:術(shù)后48 h；B：術(shù)后1周；C：術(shù)后2周；D:術(shù)后3周；E:術(shù)后4周；F:術(shù)后5周；G:術(shù)后6周。

圖4 各組HE染色(×200)

圖5 術(shù)后1周、4周行全子宮切除IL-6、TNF-α、HMGB1免疫組織化學(xué)(×200)

3 討 論

細(xì)胞因子是多種細(xì)胞所分泌的，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能、參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等小分子多肽的統(tǒng)稱。TNF-α、IL-6、HMGB1等促炎細(xì)胞因子在生物損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展的病理過程中扮演重要的角色[1]。TNF-α由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，有免疫調(diào)節(jié)、參與發(fā)熱和炎癥發(fā)生的功能，參與全身炎癥反應(yīng)并在調(diào)控炎癥反應(yīng)急性期中起著重要的作用[2]。TNF-α 等炎癥因子在膿毒血癥早期迅速升高并達(dá)到峰值，并且TNF-α升高程度與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)[3]。Zhao等[4]認(rèn)為TNF-α在生殖道感染中發(fā)揮著重要作用。Su等[5]認(rèn)為IL-6是多功能炎性細(xì)胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用，IL-6可作為細(xì)菌性感染早期的標(biāo)志物且優(yōu)于降鈣素原。楊龍等[6]對(duì)顱內(nèi)感染患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，認(rèn)為IL-6與顱內(nèi)感染的發(fā)生及患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為判斷患者病情及預(yù)后的指標(biāo)。陳凱[7]認(rèn)為嚴(yán)重?zé)齻颊叩难獫{TNF-α、IL-6水平與燒傷程度呈正相關(guān)，其活性持續(xù)維持在高水平可能與患者發(fā)生膿毒血癥及多系統(tǒng)器官功能衰竭(MODS)密切相關(guān)。張力等[8]通過對(duì)口腔頜面部手術(shù)后感染進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)后感染患者的血清中炎癥因子IL-6、TNF-α等水平明顯升高。HMGB1是含量豐富的非組蛋白核蛋白，釋放到胞外作為致炎細(xì)胞因子是在對(duì)內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的研究中發(fā)現(xiàn)的。奉有才等[9]研究認(rèn)為，在炎癥作用下細(xì)胞核內(nèi) HMGB1通過包膜釋放到細(xì)胞外，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，引起單核巨噬細(xì)胞釋放促炎因子，并促進(jìn)HMGB1的釋放，從而引起炎癥放大和加重。臨床研究顯示，膿毒血癥患者的血清中HMGB1水平明顯高于健康人，HMGB1蛋白質(zhì)在炎癥后期或膿毒癥中發(fā)揮重要的作用[10]。陳曉林等[11]認(rèn)為HMGB1在膿毒癥大鼠小腸組織中的表達(dá)升高，并與大鼠膿毒癥的嚴(yán)重性相關(guān)。

關(guān)于宮頸錐形切除術(shù)后何時(shí)可以行后續(xù)的全子宮切除目前尚無定論。韓秀琴等[12]認(rèn)為宮頸錐形切除后，盆腔通常有炎性反應(yīng)和充血，創(chuàng)面滲液較多，常出現(xiàn)發(fā)熱。Li等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸錐形切除術(shù)后48 h至術(shù)后6周行全子宮切除并發(fā)癥明顯高于術(shù)后48 h內(nèi)及術(shù)后6周后行子宮切除者和無宮頸錐形切除的子宮切除患者。譚先杰等[14]對(duì)宮頸錐形切除術(shù)后48 h至術(shù)后6周和術(shù)后6周后再次行子宮切除患者的術(shù)后體溫等因素進(jìn)行比較，認(rèn)為宮頸錐形切除后再次手術(shù)一般應(yīng)在術(shù)后6周后。但有學(xué)者認(rèn)為[15]，不論宮頸錐形切除與隨后子宮切除術(shù)或子宮根治術(shù)的時(shí)間間隔如何，術(shù)后的臨床情況均無顯著性差異，可以在患者狀態(tài)良好的任何時(shí)間行子宮切除術(shù)，并非一定在宮頸錐形切除術(shù)后48 h內(nèi)或6周以后。筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，宮頸錐形切除后1～2周行子宮切除的患者手術(shù)并發(fā)癥及術(shù)后感染均高于其他時(shí)間段患者，并出現(xiàn)嚴(yán)重的尿路感染、腸道感染和陰道殘端感染出血，而宮頸錐形切除術(shù)后4周為患者進(jìn)行子宮切除術(shù)，臨床并發(fā)癥及術(shù)后感染明顯減少，未出現(xiàn)明顯腸道、泌尿道感染及陰道殘端出血[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下宮頸錐形切除術(shù)后1周行全子宮切除宮頸組織炎性因子浸潤，TNF-α、IL-6、HMGB1的表達(dá)水平明顯高于術(shù)后4周。熒光實(shí)時(shí)定量PCR法動(dòng)態(tài)定期檢測發(fā)現(xiàn)，宮頸錐形切除術(shù)后1～2周宮頸分泌物及組織中TNF-α、IL-6和HMGB1的表達(dá)水平達(dá)到高峰，之后逐漸降至術(shù)前水平。表明宮頸錐形切除術(shù)后1～2周時(shí)宮頸創(chuàng)面的炎癥在宮頸創(chuàng)面恢復(fù)過程中最為嚴(yán)重，如果此時(shí)行后續(xù)的子宮切除勢(shì)必出現(xiàn)術(shù)中出血多、手術(shù)時(shí)間延長，手術(shù)并發(fā)癥及術(shù)后感染率高。因此，筆者建議避免在宮頸錐形切除術(shù)后1～2周行子宮切除，這樣能規(guī)避因手術(shù)時(shí)機(jī)選擇不當(dāng)而增加的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、手術(shù)并發(fā)癥及術(shù)后感染。本研究還顯示，宮頸分泌物與宮頸組織中炎性細(xì)胞消長類似，由于宮頸分泌物取材方便可行，因而通過分泌物中炎癥因子的監(jiān)測選擇宮頸錐形切除術(shù)后子宮全切術(shù)最佳手術(shù)時(shí)間具備可行性。

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醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作的基本內(nèi)容

按工作性質(zhì)及其先后順序，可將醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作分為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、收集資料、整理資料、分析資料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是開展某項(xiàng)醫(yī)學(xué)研究工作的關(guān)鍵，包括醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)，醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括研究對(duì)象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)方法等。收集資料的方法包括各種試驗(yàn)、檢測或調(diào)查，要求資料完整、準(zhǔn)確、及時(shí)、有足夠數(shù)量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對(duì)、對(duì)資料進(jìn)行分組與匯總等。分析資料即對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)推斷。

The expression and significance of TNF-α,IL-6,HMGB1 in the cervix uteri after the prior cervical conization*

YinXinming,ZhuXiaolan,WenJian,ZhuLi,TanWeiwei,LiuSongping

(DepartmentofGynecology,ZhenjiangMaternalandChildHealthHospital,theFourthAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To investigate the dynamic changes and its significance of inflammatory factors in cervical secretions and prior cervical tissues after cervical conical resection.Methods Women who received prior cervical conization during December 2013 and December 2015 in this hospital were selected,then the cervical tissue and secretion were collected regular interval after the conization.The expression of tumor necrosis factor-α(TNF),interleukin-6(IL-6) and high mobility group protein 1 (HMGB1) were quantitative detected and analyzed.The expression and infiltration of inflammatory cell were detected by HE and immunohistochemical staining.Results The expression of TNF-α,IL-6 and HMGB1 in cervical tissues and secretions increased gradually after priorcervical conization,which reached the peak at 1 to 2 weeks after priorcervical conization,and then gradually decreased,the differences were statistically significant when compared with the preoperative control group (P<0.05).The inflammatory cell infiltration and the inflammatory response were most severe at 1st week after the conization.The expression of TNF-α,IL-6 and HMGB1 was at 1st week after the conization were significantly higher than that of the 4thweek group.Conclusion The cervical inflammatory were most severe after the prior cervical conization about 1-2weeks,and the hysterectomy should be avoided at this stage.

prior cervical conization;hysterectomy;tumor necrosis factor-alpha;interleukin-6;high mobility group proteins;postoperative infection

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.009

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81402165,81672913);江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20141288);江蘇省鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展基金資助項(xiàng)目(SH2013088)。 作者簡介：殷新明(1973-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤、普通婦科臨床工作。

R711.74

A

1671-8348(2017)11-1472-04

2016-11-11

2016-12-27)