王 敏，廖鵬程，劉瓊瑤，譚 紅，張 緒，聶敏海

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜科/西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

4NQO誘導(dǎo)大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中E-cad及PCNA的表達(dá)研究*

王 敏，廖鵬程，劉瓊瑤，譚 紅，張 緒，聶敏海△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜科/西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000)

目的 研究上皮鈣依賴黏附蛋白(E-cad)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在大鼠口腔黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)變化,探討其相關(guān)性。方法 采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)飲水法誘導(dǎo)大鼠舌癌變模型，免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)82只大鼠舌癌變過(guò)程不同病理階段組織中E-cad、PCNA蛋白的表達(dá)，分析E-cad與PCNA相關(guān)性。結(jié)果 在正常黏膜、上皮單純?cè)錾⑤p度上皮異常增生、中重度上皮異常增生和舌鱗狀細(xì)胞癌組織中，E-cad的陽(yáng)性率分別是100%、95.24%、92.86%、80.00%、68.75%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCNA的陽(yáng)性率分別是9.52%、14.29%、35.71%、50%、56.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.676，P<0.05)。二者的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.614，P<0.01)。結(jié)論 E-cad和PCNA有望成為舌黏膜癌變的生物標(biāo)志物之一。

舌腫瘤；癌，鱗狀細(xì)胞；動(dòng)物模型； E-cad；PCNA；免疫組織化學(xué)

口腔鱗狀細(xì)胞癌尤其是舌鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性強(qiáng)，惡性度高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。上皮鈣依賴黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)是存在于上皮組織中的細(xì)胞黏附分子，是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因素[2]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)已被廣泛認(rèn)可，與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。細(xì)胞黏附能力下降與增殖活躍在口腔癌變中的相互關(guān)系，尚無(wú)確切定論。本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)E-cad和PCNA蛋白在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)情況及意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)取得西南醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)原則。90只6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠(200±10)g購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-17]。嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行E-cad、PCNA的免疫組織化學(xué)染色，陽(yáng)性對(duì)照采用已知E-cad和PCNA陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液。兔抗大鼠E-cad多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、兔抗大鼠PCNA多克隆抗體(美國(guó)CST公司)、免疫組織化學(xué)試劑盒SP-0023(SP，博奧森生物技術(shù)有限公司)、即用型DAB顯色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組,每組15只，分3籠喂養(yǎng)，A、B、C、D、E組為實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)組為對(duì)照組。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)屏障環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)組采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%的4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO，美國(guó)Sigma公司)SPF級(jí)動(dòng)物專用純凈滅菌水溶液誘癌，對(duì)照組飲SPF級(jí)動(dòng)物專用純凈滅菌水，分別于第10周(A組)、14周(B組)、18周(C組)、22周(D組)、24周(E、F組)，分5批乙醚麻醉、頸椎脫臼處死，取舌黏膜組織標(biāo)本，一部分組織標(biāo)本于液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，另一部分組織標(biāo)本即刻4%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)，梯度乙醇脫水、石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，病理分級(jí)參照WHO2005年標(biāo)準(zhǔn)，由西南醫(yī)科大學(xué)兩位高年資病理醫(yī)師共同讀片確定病理分級(jí)。

1.2.2 結(jié)果判定 E-cad的陽(yáng)性染色以細(xì)胞膜為主，PCNA為細(xì)胞核。組織染色強(qiáng)度記分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)為0分，弱為1分，中等強(qiáng)度為2分，強(qiáng)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行評(píng)級(jí)記分，待觀測(cè)切片在400倍視野下隨機(jī)選定5個(gè)視野觀察：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。每張切片細(xì)胞染色情況總記分為組織染色強(qiáng)度記分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分之和。按照總記分分值分為：0～1分為陰性(-)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)歸為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用等級(jí)資料的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis Test)，多個(gè)樣本間兩兩比較的秩和檢驗(yàn)及χ2趨勢(shì)檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠舌黏膜癌建模 實(shí)驗(yàn)組大鼠之間斗毆死亡1只，麻醉意外死亡1只，癌發(fā)后身體衰竭死亡6只，共獲有效實(shí)驗(yàn)對(duì)象82只，實(shí)驗(yàn)組病理分級(jí)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.267，P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)中，由于中度上皮異常增生和重度上皮異常增生樣本含量較少，在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)不能成為獨(dú)立的分析組，遂將其歸為一個(gè)分析組。其中正常黏膜21只，上皮單純?cè)錾?1只，輕度上皮異常增生14只，中重度上皮異常增生10只，舌鱗狀細(xì)胞癌16只。

2.2 E-cad在大鼠正常舌黏膜和癌變各階段組織中的表達(dá) 在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中，E-cad蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，并且由單純的細(xì)胞膜表達(dá)為主，發(fā)展到細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)均有較明顯表達(dá)，見(jiàn)圖1。各組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.308，P=0.004)，見(jiàn)表1。

表1 E-cad在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)比較

A:正常舌黏膜；B：上皮單純?cè)錾籆：輕度上皮異常增生；D：中重度上皮異常增生；E：舌鱗狀細(xì)胞癌。

圖1 E-cad在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達(dá)(SP×200)

2.3 PCNA在大鼠正常舌黏膜和癌變各階段組織中的表達(dá) 在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中,PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，主要表達(dá)于基底細(xì)胞層的細(xì)胞核內(nèi)，見(jiàn)圖2。各組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.676，P=0.002)，見(jiàn)表2。

表2 PCNA在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中的表達(dá)

2.4 E-cad與PCNA在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，PCNA表達(dá)為陽(yáng)性者，其E-cad較多的表達(dá)為陰性,反之亦然。Spearman相關(guān)分析顯示，二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.614，P=0.000)，隨病變程度加重，E-cad表達(dá)下降，而PCNA表達(dá)增強(qiáng)。見(jiàn)表3。

表3 在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中E-cad和 PCNA表達(dá)相關(guān)性分析(n)

A:正常舌黏膜；B：上皮單純?cè)錾?；C：輕度上皮異常增生； D：中重度上皮異常增生；E：舌鱗狀細(xì)胞癌。

圖2 PCNA在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達(dá)(SP×400)

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，尚無(wú)確切的早期診斷方法。4NQO飲水法誘導(dǎo)大鼠口腔癌變建立口腔鱗狀細(xì)胞癌的動(dòng)物模型較為成熟，對(duì)研究口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、治療、預(yù)防措施具有重要意義[3]。

E-cad是上皮組織中一類依賴鈣離子的細(xì)胞黏附分子。人類的E-cad編碼基因 CDH1定位于16q22.1[4]；大鼠與人類稍有不同，其定位于19q12。在維持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮極性上具有重要意義[5]，是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因素[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)E-cad與口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化程度，發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。E-cad能否作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后指標(biāo)，尚存在爭(zhēng)議[7-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：E-cad在正常黏膜上皮的基底部細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系緊密，E-cad的表達(dá)相對(duì)較多，染色強(qiáng)度也高，可達(dá)到100%；顆粒層到角質(zhì)層細(xì)胞數(shù)少、排列疏松，其陽(yáng)性著色強(qiáng)度相對(duì)較弱。從中度和重度上皮異常增生到舌鱗狀細(xì)胞癌階段，E-cad陽(yáng)性率持續(xù)下降，細(xì)胞排列紊亂無(wú)序，可見(jiàn)其在維持上皮正常結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵性作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了E-cad在大鼠舌黏膜從正常-上皮單純?cè)錾?輕度上皮異常增生-中重度上皮異常增生-鱗狀細(xì)胞癌這一動(dòng)態(tài)癌變過(guò)程中的表達(dá)變化，隨著病變程度加重，組織中E-cad表達(dá)降低，表達(dá)部位由細(xì)胞膜表達(dá)為主發(fā)展至細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞間、細(xì)胞與組織間黏附降低，促使舌黏膜組織異型性提高直至舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生。與Hung等[9]研究E-cad在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)結(jié)果一致，因此筆者推測(cè)組織中E-cad表達(dá)下調(diào)可能是口腔黏膜癌變過(guò)程的早期事件。

PCNA是公認(rèn)的反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的一種核蛋白，基因定位于人染色體20p12,參與細(xì)胞周期調(diào)控、復(fù)制、修復(fù)和凋亡等細(xì)胞重要事件[10]。PCNA與細(xì)胞增殖、病變活躍和惡性程度密切相關(guān)[11]，不僅可以評(píng)估口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化和分級(jí)，還能作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物、評(píng)估口腔鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后。本研究結(jié)果表明：從正常舌黏膜到舌鱗狀細(xì)胞癌的過(guò)程中，雖然PCNA總體表達(dá)程度均不高，舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)率最高為56.25%,其表達(dá)仍然能夠呈現(xiàn)由低到高的增長(zhǎng)趨勢(shì)，反映舌黏膜癌變過(guò)程中組織細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。與Madan等[12]研究結(jié)果一致。推測(cè)PCNA一定程度上可反映腫瘤細(xì)胞的異常增殖。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠舌黏膜癌變過(guò)程中，PCNA表達(dá)隨病變程度的增加上調(diào)，E-cad表達(dá)隨病變程度的增加下調(diào)，與Lim等[13]對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌生存分析結(jié)果一致，即E-cad低表達(dá)和PCNA高表達(dá)可反映口腔鱗狀細(xì)胞癌的不良預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，PCNA和E-cad蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與翁密霞等[14]研究PCNA和E-cad在非小細(xì)胞肺癌中的結(jié)果一致。PCNA反映的是細(xì)胞的增殖活性，在癌變過(guò)程中就體現(xiàn)了癌變細(xì)胞的增殖能力，說(shuō)明在此過(guò)程中，癌變區(qū)舌黏膜細(xì)胞具有高度的增殖活性，細(xì)胞間的黏附能力下降更容易脫離原有細(xì)胞群，侵入周邊其他組織。因此筆者推測(cè)聯(lián)合檢測(cè)E-cad和PCNA對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有重要意義，有望成為舌黏膜癌變的標(biāo)志物。然而口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制是一個(gè)涉及多因素，多體系，多種蛋白分子的復(fù)雜過(guò)程，E-cad表達(dá)下調(diào)和PCNA增殖活躍在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制，仍需采用更多分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步深入研究E-cad和PCNA的相關(guān)性及在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的作用與意義。

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Expression of E-cadherin and PCNA in the process of tongue mucosal carcinogenesis induced by 4NQO in rats*

WangMin,LiaoPengcheng,LiuQiongyao,TanHong,ZhangXu,NieMinhai△

(DepartmentofOralMucosa,theAffiliatedStomatologicalHospitalofSouthwestMedicalUniversity/LaboratoryofOralandMaxillofacialReconstructionandRegeneration,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To evaluate the expression of epithelial cadherin (E-cad) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in various stages of tongue carcinogenesis and explore its relevance.Methods SP immunohistochemical method was employed to detect the expression of E-cad and PCNA protein in 82 rat tongue carcinogenesis specimens which induced by 4-nitroquinoline 1-oxide(4NQO).Chi-square test for trend and the spearman correlation were used to analysis the correlation between E-cad and PCNA.Results In normal mucosa,epithelial hyperplasia,mild dysplasia,severe dysplasia and squamous cell carcinoma,the positive rate of E-cad were 100%,95.24%,92.86%,80%,68.75%,the differences were statistically significant(P<0.05);The positive rate of PCNA were 9.52%,14.29%,35.71%,50%,56.25%,the difference were statistically significant(χ2=16.676,P<0.05).The expression of E-cad and PCNA has negative correlation(r=-0.614,P<0.01).Conclusion E-cad and PCNA may be one of the biomarkers of carcinogenesis of tongue mucosa.

tongue neoplasms;carcinoma,squamous cell;animal model;E-cad;PCNA;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.004

四川省科技廳課題(2014LY-62)。 作者簡(jiǎn)介：王敏(1990-)，碩士，主要從事口腔黏膜病的病因和防治研究。△

,E-mail:nieminhai@126.com。

R739.8

A

1671-8348(2017)11-1454-03

2016-10-17

2016-12-23)