胡文壇，王婷婷，張世杰，何 鑫，張靖宇,劉紅春△

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450003；2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450002)

·論 著·

以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的藥物篩選模型的建立研究*

胡文壇1，王婷婷1，張世杰1，何 鑫2，張靖宇1,劉紅春1△

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450003；2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450002)

目的 以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，建立體外藥物篩選細(xì)胞模型，并對中草藥小分子化合物進(jìn)行篩選。方法 將人PRDM1基因啟動子序列(267、1 257 bp)克隆入熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-PRDM1并與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，通過檢測熒光素酶報告基因表達(dá)水平的變化反映PRDM1基因啟動子的啟動轉(zhuǎn)錄活性，并對共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例、工具細(xì)胞選擇等條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，相關(guān)藥物處理進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 成功構(gòu)建了熒光素酶報告載體pGL3-PRDM1。用0.5、1、2、4 μmol/L的5-Aza-CdR處理重組的U266細(xì)胞篩選模型，與0 μmol/L 5-Aza-CdR相比，增加5-Aza-CdR 的刺激，熒光強(qiáng)度及PRDM1基因啟動子的活性呈劑量依賴性增強(qiáng)。與0 μmol/L相比，青蒿琥酯從5 μmol/L濃度開始對PRDM1基因啟動子活性呈明顯降低(P<0.05)，在20 μmol/L濃度時降到最低；白芍總苷呈現(xiàn)小劑量促進(jìn)PRDM1啟動子活性，高劑量抑制PRDM1基因啟動子活性。青蒿琥酯對細(xì)胞生長增殖影響較小，白芍總苷對細(xì)胞生長增殖的影響較復(fù)雜。結(jié)論 成功建立了以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的藥物篩選模型，并篩選出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因啟動子活性。

PRDM1基因；雙熒光素酶報告基因；中草藥；藥物篩選

B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白(B lymphocyte induced maturation protein,Blimp)-1,稱為正向調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白(positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM)1,由PRDM1基因編碼,具有5個鋅指結(jié)構(gòu)。Morgan等[1]研究結(jié)果證實(shí)，Blimp-1基因存在不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和亞型，并于外顯子1上游70 kb處存在1個附加外顯子,使其具有2種亞型：Blimp-1α和-1β，分別由PRDM1α和PRDM1β編碼，前者在調(diào)節(jié)漿細(xì)胞分化發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄因子作用，后者由于功能缺陷失去了對多個靶基因的調(diào)控作用，所以傳統(tǒng)意義上所說的Blimp-1蛋白是指Blimp-1α[2]。在B細(xì)胞系，PRDM1基因表達(dá)的Blimp-1特異地表達(dá)于所有抗體分泌細(xì)胞，包括漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞[3]，是維持骨髓中長壽漿細(xì)胞形成及Ig分泌所必需的轉(zhuǎn)錄因子，是長期維持抗原特異免疫反應(yīng)所必需。正常情況下，Blimp-1參與機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答的形成并維持穩(wěn)定狀態(tài)，但Blimp-1表達(dá)或調(diào)控異常時，將使免疫功能紊亂，多克隆B細(xì)胞激活、多種自身抗體大量產(chǎn)生，誘發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化、腎小球腎炎、自身免疫性溶血性貧血等疾病，而干擾Blimp-1表達(dá)會使相關(guān)自身抗體水平降低，抑制B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，病情得到緩解，發(fā)病延緩[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選模型尋求Blimp-1表達(dá)下調(diào)劑，在分離提取的中草藥免疫活性成分中進(jìn)行篩選。包括多糖類、皂苷類、類黃酮類、有機(jī)酸類、多酚類和萜類等多種成分被證明能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用，在免疫相關(guān)疾病的治療上也收到較好的臨床療效[6]。 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，選取PRDM1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游267 bp和1 257 bp序列作為本模型的目標(biāo)啟動子序列，再結(jié)合雙熒光素酶報告基因技術(shù)，構(gòu)建Blimp-1活性抑制劑細(xì)胞篩選模型，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是目前從分子水平用于研究分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效工具,與RT-PCR相比更快速、靈敏、簡便、適用于高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)。Mundy等[7]將含小鼠BMP-2啟動子的熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠成骨細(xì)胞系，對3萬多種化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)洛代他汀可增加報告基因活性，從而尋求到可刺激骨形成的新藥物。國內(nèi)外目前基于該方法構(gòu)建以PRDM1/Blimp-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的免疫抑制藥物篩選模型的報道尚少見。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 293T人胚腎上皮細(xì)胞，U266、ARH77人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶NheⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4 DNA連接酶購自Toyobo公司；質(zhì)?；厥赵噭┖?、DNA片段回收試劑盒和MTT細(xì)胞增殖試劑盒購自上海生工生物工程公司，LipoFiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物科技公司。胎牛血清購自浙江天杭生物公司，PRMI1640、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司。 熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic、pRL-TK和pGL3-Control，Dual-Luciferase Raporter Assay System購于美國Promega公司。凝膠成像系統(tǒng)、基因擴(kuò)增儀等。

1.2 方法

1.2.1 PRDM1基因啟動子片段的克隆及重組載體的構(gòu)建 按Ezup柱式法從培養(yǎng)的293T細(xì)胞中提取基因組DNA,并檢測核酸濃度及純度。根據(jù)GeneBank(Gene ID:639)中人類PRDM1基因序列設(shè)計引物，并在引物的上游和下游分別加入NheⅠ、HindⅢ及KpnⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。合成PRDM1基因的267 bp啟動子和1 257 bp啟動子，其中267 bp啟動子的上游引物：5′-CGG CTA GCG CTA GCA ATC TGG GGG AAA G-3′；下游引物：5′-CCA AGC TTA AGC TTC TCG GCG GTC CCT C-3′；1 257 bp啟動子上游引物：5′-ATG CGG TAC CCC TAC CTA TGG TAA GGC AAG CA-3′；下游引物：5′-ATC GCT CGA GTC GTT CAT CTC TAC CCA GTC C-3′；下劃線為設(shè)計的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，反應(yīng)條件為94 ℃變性5 min;循環(huán)為94 ℃ 30 s(267 bp)/94 ℃ 45 s(1 257 bp),57 ℃ 30 s(267 bp)/60 ℃ 30 s(1 257 bp),72 ℃ 30 s,共進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72 ℃延伸2 min。取2 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。利用DNA片段回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增片段，回收的PCR片段經(jīng)過雙酶切后送至上海生工生物公司進(jìn)行測序，測序正確的人PRDM1基因啟動子片段連接到pTA載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pTA2-PRDM1，純化并分別克隆至經(jīng)雙酶切的pGL3-Basic載體，以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，雙酶切鑒定篩選陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒pGL3-PRDM1(267 bp)/(1 257 bp),送至上海生工生物公司測序鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報告基因檢測評價啟動子活性 取對數(shù)生長期293T人胚腎上皮細(xì)胞，U266和ARH77人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，以每孔5.0×105接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至80%左右，按脂質(zhì)體LipoFiterTM試劑說明書，采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pGL3-PRDM1(267 bp)/(1 257 bp)和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK分別共轉(zhuǎn)染入293T、U266及ARH77細(xì)胞，同時以pGL-Basic及pGL-SV40和pRL-TK共轉(zhuǎn)染作為陰性、陽性對照，并用optiMEM 10%,DMEM完全培養(yǎng)基對瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后更換成DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)基。按照雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測在重組細(xì)胞293T、U266、ARH77細(xì)胞中pGL3-PRDM1的熒光素酶的活性。每孔加入2 mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，每孔細(xì)胞用PBS洗滌2次，分別加入細(xì)胞裂解液，置搖床上，室溫120 r/min,振搖20 min,收集細(xì)胞裂解液。取細(xì)胞裂解液上清20 μL,加入熒光素酶檢測試劑Ⅱ 100 μL,用化學(xué)發(fā)光檢測儀LumunometerTD-20/20(美國Turner Bio Systems 公司產(chǎn)品)檢測螢火蟲熒光素酶活性;再加入海腎熒光素酶檢測試劑(Stop Glo 試劑)100 μL,將上述反應(yīng)猝滅,并啟動海腎熒光素酶反應(yīng),檢測海腎熒光素酶活性。熒光素酶活性用每組螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值來表示(即啟動子活性)。

1.2.3 藥物篩選模型的驗(yàn)證 DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)對PRDM1基因啟動子有明顯的誘導(dǎo)激活作用[8]。因此，本研究采用5-Aza-CdR來驗(yàn)證該篩選方法是否可以檢測PRDM1啟動子激活效應(yīng)，同時用RT-PCR來檢測Blimp-1 mRNA的表達(dá)變化。

1.2.4 篩選中草藥小分子化合物對PRDM1啟動子的作用 對已有研究報道的對動物體B細(xì)胞的增殖及抗體生成有調(diào)節(jié)作用的中草藥小分子提取物[9-10]，如黃芪(Astragalus)、人參皂苷(ginsenoside)、白芍總苷(Total glucosides of paeony,TGP)、雷公藤多苷(Tripterygium glycoside,TWP)、靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides,GLPS)及青蒿素的衍生物青蒿琥酯(Artesunate,ASUN)等，在構(gòu)建模型的基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行檢測其對重組細(xì)胞熒光素酶基因活性及PRDM1基因啟動子的影響。

1.2.5 以MTT法檢測對構(gòu)建藥物篩選模型所需細(xì)胞系生長曲線的影響 取生長狀態(tài)良好的U266細(xì)胞，以每孔5×103接種96孔板中，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度篩選出的能抑制PRDM1基因啟動子活性的小分子化合物。每24小時進(jìn)行MTT法測定560 nm處吸光度值(OD值)，并連續(xù)記錄6 d,以培養(yǎng)時間為橫軸，OD值為縱軸，做不同藥物對U266細(xì)胞生長曲線的影響。

2 結(jié) 果

2.1 PRDM1基因啟動子序列的克隆、鑒定及表達(dá)載體的構(gòu)建 從293T細(xì)胞中提取總DNA為模板PCR擴(kuò)增出PRDM1基因的啟動子片段，通過瓊脂糖凝膠電泳成像顯示在約267 bp、1 257 bp處有特異性條帶，與PRDM1啟動子目的片段大小一致(圖1A)。純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行DNA測序，結(jié)果顯示與GenBank中登錄的PRDM1基因序列完全一致。構(gòu)建的重組載體pGL3-PRDM1，PRDM1啟動子267 bp、1 257 bp成功插入到pGL3-Basic載體中(圖1B、C)。

2.2 選取熒光素酶表達(dá)活性更高的模型進(jìn)行優(yōu)化 由于細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染效率受脂質(zhì)體的量、脂質(zhì)體與DNA的比例，兩種質(zhì)粒之間的比例和宿主細(xì)胞等多種因素的影響，為了獲得較強(qiáng)的啟動子活性，對pGL3-PRDM1與pRL-TK共轉(zhuǎn)染比例進(jìn)行探索，設(shè)置pGL3-PRDM1與pRL-TK的轉(zhuǎn)染比例為1∶1、2∶1、4∶1及8∶1分別瞬時轉(zhuǎn)染293T、U266、ARH77細(xì)胞，以pGL3-Basic、pGL3-Control作為陰、陽性對照，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)兩復(fù)孔，并重復(fù)3次。兩段不同長度啟動子構(gòu)建的熒光素酶報告載體pGL3-PRDM1(267 bp/1 257 bp)且與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK在轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞株時均以2∶1共轉(zhuǎn)染比例時的熒光素酶表達(dá)活性更高(圖2A～C)，且以1 257 bp長度啟動子構(gòu)建的熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞系熒光素酶表達(dá)活性最高(圖2D)，因此以pGL3-PRDM1(1 257 bp)轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞為最終選定的熒光素酶報告載體細(xì)胞篩選模型，且與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK以2∶1的比例共轉(zhuǎn)染進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A:PRDM1基因啟動子的克隆片段;B、C：構(gòu)建的重組載體后經(jīng)雙限制性內(nèi)切酶切后的片段；M：Maker DL10 000;1*：PRDM1啟動子片段(267 bp);2*：PRDM1 啟動子片段(1 257 bp);1：PRDM1 啟動子(1 257 bp);1′：PRDM1啟動子(267 bp)； 2、2′：pGL3-Basic；3、3′：重組載體pGL3-PRDM1(1 257 bp/267 bp)；4：1 257 bp啟動子構(gòu)成的重組載體酶切后pGL3-PRDM1/HindⅢ+KpnⅠ(4 800 bp+1 257 bp)；4′：267 bp構(gòu)成的重組載體酶切后pGL3-PRDM1/NheⅠ+HindⅢ(4 800 bp+267 bp)。

圖1 PRDM1基因啟動子的克隆片段及酶切片段

A:293T細(xì)胞;B：H929細(xì)胞;C:U266細(xì)胞；D:各組相對熒光活性。

圖2 各組相對熒光活性比較

2.3 不同藥物對PRDM1啟動子的誘導(dǎo)作用

2.3.1 藥物篩選模型的驗(yàn)證 用0.5、1、2、4 μmol/L的5-Aza-CdR處理重組的U266細(xì)胞篩選模型，與0 μmol/L 5-Aza-CdR相比，增加5-Aza-CdR 的刺激，熒光強(qiáng)度及PRDM1基因啟動子的活性呈劑量依賴性增強(qiáng)，見圖3。用RT-PCR檢測Blimp-1 mRNA的表達(dá)水平也與之對應(yīng)，隨5-Aza-CdR劑量增加而表達(dá)增加，各劑量組Blimp-1基因mRNA分別為0.723±0.121、0.954±0.011、1.987±0.125、3.012±0.213、4.562±0.097，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該篩選方法可以用于篩選針對PRDM1基因的小分子抑制劑的研究，雙熒光素酶報告基因法檢測PRDM1基因啟動子活性具有極高的靈敏性。該方法可以采用微孔板處理細(xì)胞并直接測定熒光強(qiáng)度，可以高通量篩選針對Blimp-1的免疫抑制藥物。

2.3.2 不同濃度青蒿琥酯和白芍總苷對PRDM1啟動子活性的影響 經(jīng)過反復(fù)的篩庫工作及不斷地重復(fù)和確定，最終得到對PRDM1啟動子活性有影響的化合物，分別是對PRDM1啟動子抑制作用的青蒿琥酯及對PRDM1啟動子呈現(xiàn)低濃度增強(qiáng)、高濃度抑制的白芍總苷。結(jié)果顯示，與0 μmol/L相比，青蒿琥酯從5 μmol/L濃度開始對PRDM1基因啟動子活性呈明顯降低(P<0.05)，在20 μmol/L濃度時降到最低；白芍總苷呈現(xiàn)小劑量促進(jìn)PRDM1啟動子活性，高劑量抑制PRDM1基因啟動子活性。見圖4。

2.3.3 MTT法檢測青蒿琥酯和白芍總苷對U266細(xì)胞生長增殖的影響 青蒿琥酯低劑量(≤20 μmol/L)，其對細(xì)胞生長增殖影響較小，生長抑制率小于或等于10.5%；再增加劑量時，細(xì)胞毒性較明顯，OD值顯著小于0 μmol/L組(P<0.01)，生長增殖明顯受抑制。白芍總苷對細(xì)胞生長增殖的影響較復(fù)雜，≤5 μmol/L時，對細(xì)胞生長增殖的影響較小，對PRDM1啟動子起增強(qiáng)激活的作用；≥20 μmol/L時，熒光強(qiáng)度明顯減弱，對細(xì)胞生長增殖的抑制較明顯，生長抑制率大于或等于31.3%。見表1、2。

圖3 在U266細(xì)胞中不同濃度的5-Aza-CdR 對PRDM1基因啟動子活性的影響

A:青蒿琥酯；B：白芍總苷。

圖4 不同濃度青蒿琥酯和白芍總苷對PRDM1 啟動子活性影響表1 青蒿琥酯對U266細(xì)胞生長增殖的影響

*:P<0.01,與0 μmol/L比較。

表2 白芍總苷對U266細(xì)胞增殖生長的影響

*:P<0.01,與0 μmol/L比較。

3 討 論

Blimp-1在促進(jìn)B細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用，主要通過3個基因表達(dá)程序誘導(dǎo)了漿細(xì)胞發(fā)育[11-12]：(1)Blimp-1阻斷B細(xì)胞增生程序，主要包括直接抑制c-myc，下調(diào)E2F-1及抗凋亡基因A1,上調(diào)cdk抑制子p18和p21；(2)Blimp-1上調(diào)促使Ig分泌的基因，包括Ig重鏈及輕鏈基因、J鏈、XBP-1等；(3)Blimp-1下調(diào)在形成生發(fā)中心和B細(xì)胞激活中起重要作用的基因，包括Pax-5、Bcl-6、AID、BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因等。以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的抑制性分子將可能通過抑制漿細(xì)胞分化及抗體的產(chǎn)生，用于抗體所致自身免疫性疾病的治療，并且由于成年后PRDM1的表達(dá)局限于生發(fā)中心晚期的B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞[3]，在其他組織器官無表達(dá)，以PRDM1為靶標(biāo)的藥物可能主要影響抗體的產(chǎn)生，而對尚存在補(bǔ)救途徑的正常細(xì)胞免疫、固有免疫等免疫功能無太大影響，有可能成為高度特異、選擇性的免疫性疾病治療藥物，為抗體所致免疫性疾病的治療提供新的途徑。

本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,雙熒光素酶法檢測,成功構(gòu)建以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的雙熒光素酶報告基因藥物篩選模型,根據(jù)信號比和靈敏度,確立了實(shí)驗(yàn)最佳條件:選擇pGL3-PRDM1和pRL-TK的共轉(zhuǎn)染比例為2∶1,以1 257 bp長度片段為活性較高啟動子來構(gòu)建熒光素酶報告載體，確定U266細(xì)胞為工具細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)。鑒于PRDM1基因啟動子CpG島區(qū)域存在著較高程度的甲基化，使PRDM1基因表達(dá)受抑，而DNA甲基化抑制劑5-Aza-CdR可誘導(dǎo)PRDM1基因去甲基化再誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活[13]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用5-Aza-CdR作為陽性藥來驗(yàn)證該篩選方法是否可行,結(jié)果顯示5-Aza-CdR能明顯增強(qiáng)PRDM1基因啟動子的活性,并與其mRNA的表達(dá)變化相符,說明藥物篩選模型構(gòu)建成功。對現(xiàn)已報道對動物體B細(xì)胞的增殖及抗體生成有調(diào)節(jié)作用的中草藥小分子提取物如黃芪、人參皂苷、白芍總苷、雷公藤多苷、靈芝多糖及青蒿琥酯等200多種藥物進(jìn)行篩選試驗(yàn)，檢測加入藥物后雙熒光素酶報告基因活性的表達(dá)變化，篩選出青蒿琥酯能降低熒光強(qiáng)度，抑制PRDM1基因啟動子活性，而白芍總苷表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)、高劑量抑制的作用。

青蒿琥酯具有明顯地減少B細(xì)胞過度活化，抑制自身抗體形成的作用,用于治療MRL/lpr鼠后，發(fā)病延緩，發(fā)病程度減輕，血清抗dsDNA抗體和抗ANA抗體滴度降低，小鼠脾臟中BAFF mRNA表達(dá)水平顯著下降，其機(jī)制可能是參與體內(nèi)B細(xì)胞分化調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。但其是否參與調(diào)節(jié)PRDM1基因的表達(dá)及調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不明了，其對PRDM1基因的下調(diào)作用是初始靶點(diǎn)還是其某個上游基因的后繼效應(yīng)呢？為此，本實(shí)驗(yàn)在篩選出最佳條件的作用下，加入不同濃度的青蒿琥酯處理，觀察青蒿琥酯是否直接作用于PRDM1基因啟動子，結(jié)果表明青蒿琥酯呈劑量依賴性抑制PRDM1基因啟動子活性，并結(jié)合細(xì)胞的生長增殖曲線，≤20 μmol/L濃度時對PRDM1基因啟動子活性的抑制程度較高且細(xì)胞生長狀態(tài)影響較小，隨著濃度的加大細(xì)胞生長增殖明顯受抑制，可能與青蒿琥酯還影響細(xì)胞生長增殖的調(diào)控有關(guān)；白芍總苷也是傳統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)藥物，既能調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫，又能調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)白芍總苷具有低濃度促進(jìn)和高濃度抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，通過多種途徑抑制自身免疫反應(yīng)，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病有確切療效，其作用機(jī)制可能是通過負(fù)調(diào)節(jié)腹腔巨噬細(xì)胞(PM)產(chǎn)生IL-1及產(chǎn)生大量PGE2而抑制B細(xì)胞增殖分化[15]。因此本實(shí)驗(yàn)也檢測了白芍總苷是否抑制PRDM1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示小劑量可促進(jìn)PRDM1基因表達(dá)，大劑量會抑制PRDM1基因啟動子活性，而大劑量時對細(xì)胞生長增殖的影響較大，說明白芍總苷抑制PRDM1啟動子活性可能與細(xì)胞毒性有關(guān)。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-PRDM1,將其與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞,采用雙熒光素酶法檢測基因啟動子活性,建立了以PRDM1基因啟動子為靶點(diǎn)的藥物篩選模型,為篩選以PRDM1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的免疫抑制藥物提供了一種有效的方法,同時也豐富和發(fā)展了中草藥小分子提取物在治療自身免疫性疾病方面的機(jī)制研究，為研發(fā)新的免疫抑制劑奠定基礎(chǔ)。

[1]Morgan MA,Magnusdottir E,Kuo TC,et al.Blimp-1/Prdml alternative promoter usage during mouse development and plasma cell differentiation[J].Mol Cell Biol,2009,29(21):5813-5827.

[2]Gy?ry I,Fejér G,Ghosh N,et al.Identification of a functionally impaired positive regulatory domain Ⅰ binding factor 1 transcription repressor in myeloma cell lines[J].J Immunol,2003,170(6):3125-3133.

[3]Shaffer AL,Lin KI,Kuo TC,et al.Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program[J].Immunity,2002,17(1):51-62.

[4]Garaud JC,Schickel JN,Blaison G,et al.B cell signature during inactive systemic lupus is heterogeneous:toward a biological dissection of lupus[J].PLoS One,2011,6(8):e23900.

[5]Raychaudhuri S,Thomson BP,Remmers EF,et al.Genetic variants at CD28,PRDMl and CD2/CD58 are associated with rheumatoid arthritis risk[J].Nat Genet,2009,41(12)：1313-1318.

[6]王愛萍，徐今寧．中藥免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]．中國藥業(yè)，2011，20(3)：75-77．

[7]Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J].Science,1999,286(5446):1946-1949.

[8]Patra SK,Bettuzzi S.Epigenetic DNA-(cytosine-5-carbon) modifications:5-aza-2′-deoxycytidine and DNA-demethylation[J].Biochemistry (Mosc),2009,74(6):613-619.

[9]儲岳峰，李祥瑞，胡元亮．9種中藥成分對小鼠免疫細(xì)胞活性的影響[J]．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27(1)：97-100．

[10]Shan BE,Yoshida Y,Sugiura T,et al.Stimulating activity of Chinese medicinal herbs on human lymphocytes in vitro[J].Int J Immunopharmacol,1999,21(3):149-159.

[11]Boulet S,Daudelin JF,Labrecque N.IL-2 induction of Blimp-1 1 is a key in vivo signal for CD8+short-lived effector T cell differentiation[J].J Immunol,2014,193(4):1847-1854.

[12] Jackson DA,Elsawa SF.Factors regulating immunoglobulin production by normal and disease associated plasma cells[J].Biomolecules,2015,5(1):20-40.

[13] Watanabe Y,Toyota M,Kondo Y,et al.PRDM5 identified as a target of epigenetic silencing in colorectal and gastric cancer[J].Clin Cancer Res,2007,13(16):4786-4794.

[14]金鷗陽,張華勇,徐婷,等.青蒿琥酯治療MRL/lpr狼瘡鼠腎炎的病理變化及機(jī)制[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2007,11(7):5-9.

[15]馬麗,李作孝.白芍總苷的免疫調(diào)節(jié)功能及其臨床應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(17):244-246.

《重慶醫(yī)學(xué)》雜志對運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)方法的有關(guān)要求

1.統(tǒng)計學(xué)符號：按GB 3358-1982《統(tǒng)計學(xué)名詞及符號》的有關(guān)規(guī)定，統(tǒng)計學(xué)符號一律采用斜體。

2.研究設(shè)計：應(yīng)告知研究設(shè)計的名稱和主要方法。如調(diào)查設(shè)計(分為前瞻性、回顧性或是橫斷面調(diào)查研究)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(應(yīng)告知具體的設(shè)計類型，如自身配對設(shè)計、成組設(shè)計、交叉設(shè)計、析因設(shè)計、正交設(shè)計等)，臨床試驗(yàn)設(shè)計(應(yīng)告知屬于第幾期臨床試驗(yàn)，采用了何種盲法措施等)；主要做法應(yīng)圍繞4個基本原則(重復(fù)、隨機(jī)、對照、均衡)概要說明，尤其要告知如何控制重要非試驗(yàn)因素的干擾和影響。

4.統(tǒng)計學(xué)分析方法的選擇：對于定量資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)`計類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統(tǒng)計學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；對于定性資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件及分析目的，選用合適的統(tǒng)計學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用χ2檢驗(yàn)。對于回歸分析，應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識和散點(diǎn)圖，選用合適的回歸類型，不應(yīng)盲目套用簡單直線回歸分析；對于具有重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)回歸分析資料，不應(yīng)簡單化處理；對于多因素、多指標(biāo)資料，要在一元分析的基礎(chǔ)上，盡可能運(yùn)用多元統(tǒng)計分析方法，以便對因素之間的交互作用和多指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系做出全面、合理的解釋和評價。

5.統(tǒng)計結(jié)果的解釋和表達(dá)：應(yīng)寫明采用統(tǒng)計學(xué)方法的具體名稱(如：成組設(shè)計資料的t檢驗(yàn)、兩因素析因設(shè)計資料的方差分析、多個均數(shù)之間兩兩比較的q檢驗(yàn)等)，統(tǒng)計量的具體質(zhì)(如：t=3.45，χ2=4.68，F(xiàn)=6.79等)；在用不等式表示P值的情況下，一般情況下選用P>0.05、P<0.05和P<0.01 3種表達(dá)方式，無須再細(xì)分為P<0.001或P<0.000 1。當(dāng)涉及總體參數(shù)(如總體均數(shù)、總體率)時，再給出顯著性檢驗(yàn)結(jié)果的同時，應(yīng)再給出95%可信區(qū)間(CI)。

Establishment of drug screening model targeting PRDM1 gene promoter*

HuWentan1,WangTingting1,ZhangShijie1,HeXin2,ZhangJingyu1,LiuHongchun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450003,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,HenanCollegeofChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450002,China)

Objective To construct a double luciferase reporter gene vector with PRDM1 gene promoter as target,and establish drug screening cell model in vitro,hope to find small molecule compounds in Chinese herbal medicine library by this model.Methods Total DNA was extracted from 293T cells and it was used for amplifying the fragment contained PRDM1 gene promoter(267 bp/1 257 bp) by PCR.The amplified product was inserted into pGL3-Basic vector．The PCR product and pGL3-PRDM1 vector were verified by sequencing and alignment．The pGL3-PRDM1 and pRL-TK vector were co-transfected into engineer cells.The activity of PRDMl gene promoter could be assayed by measuring luciferase．The method was optimized by changing ratio of two vectors．Results The highest transfection efficiency and luciferase activity were found in ratio of n(pGL-PRDM1)∶n(pRL-TK)=2∶1,and with the recombinant luciferase report gene vector contained the length of 1 257 bp amplified fragment transfecting into U266 cells.Moreover,the inductor (5-Aza-CdR) of PRDM1 gene was used for authenticating the method(P<0.01),the fluoresscence in tensity and promoter activity of PRDM1 gene were enhanced in a dose dependent manner with 5-Aza-CdR.The activity of the promoter of PRDM1 gene was significantly decreased from the concentration of 5 μmol/L of Artemisinid(P<0.05). The total glucosides of paeoniflorin promoted the promoter activity of PRDM1 gene at a low concentration, and inhibited the promoter activity of PRDM1 gene at a high concentration. Artesunate has no effect on cell proliferation. The effect of total glucosides of paeony on cell proliferation was more complicated.Conclusion A drug selection model targeting PRDM1 gene promoter has been successfully established,and artesunate has been screened to inhibit the promoter activity of PRDM1 gene.

PRDM1 gene;dual-luciferase report gene；drugs,Chinese herbal；drug screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.002

河南省衛(wèi)生廳計劃指導(dǎo)項(xiàng)目(201304015)；河南省教育廳科技研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A320026);鄭州市科技局資助項(xiàng)目(141PPTGG437)。 作者簡介：胡文壇(1990-)，檢驗(yàn)技師，在讀碩士，主要從事自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及分子診斷的研究?！?/p>

,E-mail：xingyunerliu@163.com。

R965.1

A

1671-8348(2017)11-1445-05

2016-11-03

2017-01-19)