林典梁,全 松,康躍凡,易勁松,余愛麗,林 元

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬福建省婦幼保健院輔助生殖技術(shù)研究室,福州 350001;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510515)

·論 著·

玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤Grb10表達(dá)分析研究*

林典梁1,全 松2△,康躍凡1,易勁松1,余愛麗1,林 元1

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬福建省婦幼保健院輔助生殖技術(shù)研究室,福州 350001;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,廣州 510515)

目的 對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤中生長因子受體結(jié)合蛋白10(Grb10)表達(dá)進(jìn)行分析，評價其安全性。方法 收集2012年1月至2014年5月在福建省婦幼保健院產(chǎn)科門診玻璃化凍融囊胚助孕妊娠的婦女(觀察組)50例及同期自然妊娠婦女(對照組)50例病例數(shù)據(jù)和胎盤標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)、Western blot檢測胎盤Grb10蛋白的表達(dá)，Real-time PCR檢測Grb10 mRNA表達(dá)。對兩組妊娠婦女的產(chǎn)科結(jié)局及胎盤Grb10的表達(dá)進(jìn)行比較分析。結(jié)果 兩組孕齡、胎齡，胎兒性別、體質(zhì)量、身長、頭圍、腹圍比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，娩出胎盤面積、胎盤質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組胎盤組織Grb10蛋白表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、免疫組織化學(xué)評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Real-time PCR、Western blot分析結(jié)果進(jìn)一步顯示兩組胎盤組織中Grb10 mRNA與蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 玻璃化凍融囊胚助孕有可能會增加娩出胎盤的面積與質(zhì)量，但發(fā)育相關(guān)分子Grb10在胎盤的表達(dá)未見明顯改變。

囊胚；玻璃化冷凍；胎盤；Grb10

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)用于臨床已30多年，其非自然生殖的特性及缺乏臨床前安全性研究而直接臨床應(yīng)用的背景，日益引起人們對其生殖遺傳安全性的關(guān)注。雖然目前未發(fā)現(xiàn)ART可直接導(dǎo)致子代出現(xiàn)明顯畸形，但不斷有報道指出，ART子代不良健康風(fēng)險增加，生長發(fā)育問題就是其中之一，胎兒胎盤過度生長或低出生體質(zhì)量兒的風(fēng)險增高，但原因尚不明確，人們擔(dān)心可能與ART的一系列操作相關(guān)。

囊胚培養(yǎng)與胚胎冷凍為ART重要的衍生技術(shù)，近年來研究發(fā)現(xiàn)采用玻璃化凍融囊胚移植治療不孕癥患者能產(chǎn)生較好的助孕結(jié)局，其臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。但囊胚培養(yǎng)與玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于臨床時間較短，尚缺乏對于出生后嬰幼兒大樣本的長期隨訪資料，其安全性仍是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

印記基因生長因子受體結(jié)合蛋白10(growth factor receptor-bound protein10，Grb10)是一種可以控制肌肉增長的蛋白?？赡芨淖兗∪獾纳L并促進(jìn)愈合、肌肉再生和修復(fù)過程。2011年報道了一項(xiàng)小鼠行為學(xué)研究顯示印記基因Grb10的母本表達(dá)涉及胎兒成長、新陳代謝、脂肪儲存，而父本表達(dá)調(diào)控著成年小鼠的行為活動，是胚胎發(fā)育及多種生理活動中的重要基因。囊胚培養(yǎng)與玻璃化冷凍有可能通過干擾Grb10等印記基因而影響子代生長發(fā)育潛能。尤其在胚胎期，滋養(yǎng)層細(xì)胞較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對環(huán)境因素的干擾更為敏感，經(jīng)過玻璃化冷凍損傷，很可能胎盤組織發(fā)生表觀遺傳修飾異常的風(fēng)險增加。玻璃化凍融囊胚助孕產(chǎn)科結(jié)局及其娩出胎盤Grb10表達(dá)情況如何？尚未有文獻(xiàn)報道，因此本文對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤Grb10表達(dá)水平進(jìn)行分析，對其安全性進(jìn)行評估，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究方案經(jīng)福建省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論批準(zhǔn)，在進(jìn)行研究前與患者進(jìn)行詳細(xì)溝通，在充分知情同意的基礎(chǔ)上，獲得患者夫婦雙方簽字同意后，實(shí)施研究方案。收集2012年1月至2014年5月在福建省婦幼保健院產(chǎn)科門診玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女(觀察組)50例及按年齡配對同期自然妊娠婦女(對照組)50例病例數(shù)據(jù)和胎盤標(biāo)本。并對兩組孕婦的人口學(xué)資料進(jìn)行比較分析無顯著差異者納入試驗(yàn)對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：孕齡20～35歲；單胎；第1次妊娠；身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：24周前妊娠丟失病例。所有入選對象分別記錄姓名、孕齡、末次月經(jīng)、預(yù)產(chǎn)期、新生兒性別、新生兒體質(zhì)量、新生兒評分、身長、胎盤面積和體質(zhì)量、頭圍、腹圍等指標(biāo)。所有對象分娩時均收集胎盤標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標(biāo)本收集 兩組孕婦分娩時，均對胎盤進(jìn)行詳細(xì)檢查，完成胎盤測量，稱取胎盤質(zhì)量，并記錄所有胎盤相關(guān)數(shù)據(jù)。分娩后立即收集胎盤組織，避開胎盤梗死和血管瘤部分，從臍帶植入點(diǎn)旁5 cm處縱向切開胎盤組織。收集胎盤中間部分絨毛，以盡量減少其他部分對基因表達(dá)結(jié)果的影響。所有胎盤組織在冰預(yù)冷的PBS中充分漂洗后，分裝于樣品冷凍保存管中，立即投入液氮中迅速冷凍，后移入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白和基因檢測。用于組織學(xué)分析的胎盤組織用4%多聚甲醛固定保存。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測胎盤組織中Grb10蛋白表達(dá) 用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1% DEPC)進(jìn)行固定，經(jīng)70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇2次×30 min、95%乙醇2次×30 min、100%乙醇2次×30 min、二甲苯透明2次×30 min、55 ℃石蠟中2次×30 min，用銅制模具包埋組織塊。切片后，將厚度3～5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃烘烤過夜；將切片浸于二甲苯中2次×5 min、100%乙醇2次×5 min、95%乙醇2次×5 min、90%乙醇2次×5 min、85%乙醇2次×5 min、75%乙醇2次×5 min，自來水沖洗，PBS洗2次進(jìn)行脫蠟、入水。置入1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水洗1次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在微波爐內(nèi)微波輻射10 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min進(jìn)行抗原修復(fù)。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體。切片上滴加第一抗體，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加生物素化的二抗體(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6 min，充分水洗。蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗,1%鹽酸乙醇分化,1%氨水返藍(lán),充分水洗,經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇2次×5 min、95%乙醇2次×5 min、100%乙醇脫水2次×5 min、二甲苯透明2次×5 min,中性樹脂封片。按以下評分標(biāo)準(zhǔn)： A為陽性細(xì)胞數(shù)分級，<1%為0、1%～10%為1、11%～50%為2、51%～80%為3、81%～100%為4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)；免疫組織化學(xué)評分=A×B。對所有切片進(jìn)行鏡下觀察分析胎盤組織中Grb10蛋白的表達(dá)。

1.2.3 Real-time PCR檢測Grb10 mRNA表達(dá) Trizol法提取胎盤組織總RNA(Trizol裂解液購自杭州博日科技)，將總RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Bioer公司)，取5 μL cDNA應(yīng)用ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-time PCR(SYBR Green熒光染料購自Roche公司)。引物由上海生工合成，引物序列及長度見表1。Real-time PCR總反應(yīng)體系20 μL，使用Ultra SYBR Mixture 完成擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，45個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，無引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。通過實(shí)時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的動態(tài)積累量，得到各管標(biāo)本的擴(kuò)增曲線及目的序列的Ct值，同時檢測該管標(biāo)本管家基因GAPDH的Ct值，計(jì)算各管標(biāo)本待測序列的△Ct值(△Ct=目的基因Ct值-該管樣品GAPDH的Ct值)，該管標(biāo)本目的基因的相對表達(dá)量為2-ΔCt值。

表1 實(shí)驗(yàn)引物序列

1.2.4 Western blot檢測Grb10蛋白表達(dá) 胎盤組織勻漿后提取總蛋白，測定蛋白濃度備用。制備好SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，取相應(yīng)體積總蛋白樣品與5×上樣緩沖液,混勻，95 ℃變性10 min，將樣品加到凝膠孔中，電壓調(diào)至80 V，使樣品通過濃縮膠與分離膠。凝膠電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)移將凝膠上分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后將膜放入非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中孵育、標(biāo)記檢測。待PVDF膜稍晾干，加入化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，迅速用保鮮膜包好后置于暗盒內(nèi)與Kodak X膠片貼在一起曝光，時間為1 min左右。X膠片經(jīng)顯影、定影后掃描記錄，用image J軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組新生兒結(jié)果比較 兩組孕齡、胎齡，Apgar評分，胎兒性別、體質(zhì)量、身長、頭圍、腹圍比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 兩組病例娩出胎盤情況 兩組胎盤面積、胎盤質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 兩組病例娩出胎盤組織Grb10表達(dá)免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 HE染色 胎盤是由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結(jié)構(gòu)中央厚，周邊薄。胎盤的胎兒面光滑，表面覆有羊膜，臍帶附于中央或稍偏，透過羊膜可見呈放射狀走行的臍血管分支。胎盤的母體面粗糙，為剝離后的基蛻膜，可見15～30個由淺溝分隔的胎盤小葉。它由大量的叢密絨毛膜組成。叢密絨毛膜由三級絨毛干組成，絨毛干由其內(nèi)的結(jié)締組織和血管及包圍在外周的細(xì)胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層組成，見圖1。HE染色后組織學(xué)分析兩組胎盤均未見絨毛膜病變，如滋養(yǎng)層細(xì)胞過度增生、絨毛內(nèi)結(jié)締組織變性水腫、滋養(yǎng)層細(xì)胞病變等病理學(xué)改變。本研究收集的標(biāo)本均為健康胎盤，兩組均有可比性。

表2 兩組病例新生兒結(jié)果比較

表3 兩組病例娩出胎盤情況±s)

A:觀察組；B:對照組。

圖1 HE染色(×400)

2.3.2 免疫組織化學(xué)染色 兩組胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層細(xì)胞均不同程度的Grb10的表達(dá)，見圖2。兩組胎盤組織Grb10蛋白在表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、免疫組織化學(xué)評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

A:觀察組；B:對照組。

圖2 免疫組織化學(xué)染色(×400)表4 兩組病例娩出胎盤組織Grb10表達(dá)免疫組織化學(xué) 分析結(jié)果比較

2.4 兩組病例娩出胎盤組織Grb10 mRNA表達(dá)比較 結(jié)果顯示觀察組(1.02±0.02)與對照組(0.99±0.03)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.437，P>0.05)。見圖3。

圖3 Real-time PCR檢測Grb10 mRNA在胎盤 組織中的表達(dá)

2.5 兩組娩出胎盤組織Grb10蛋白表達(dá)比較 結(jié)果顯示觀察組(1.44±0.11)與對照組(1.31±0.47)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.108，P>0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測Grb10蛋白在胎盤組織 中的表達(dá)

3 討 論

囊胚培養(yǎng)與胚胎冷凍保存為ART重要的衍生技術(shù)，促排卵周期剩余胚胎培養(yǎng)成囊胚后冷凍保存，可以減少多胎的發(fā)生，以及減胎、卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險，減少患者刺激卵巢的次數(shù)、多次促排卵費(fèi)用，增加累積成功率。近年研究發(fā)現(xiàn)采用玻璃化冷凍技術(shù)，凍融囊胚移植治療不孕癥患者能產(chǎn)生較好的助孕結(jié)局，其臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。尤其對于OHSS高危患者，由于其具有年齡小、卵巢反應(yīng)性好、胚胎回收率高的特點(diǎn)，容易成功培養(yǎng)出高質(zhì)量的囊胚，冷凍保存，選擇OHSS癥狀消失后擇期解凍移植，能產(chǎn)生較好的妊娠結(jié)局。在2011年Zhu等[1]完成了110周期新鮮囊胚和136周期玻璃化凍融囊胚移植，比較發(fā)現(xiàn)解凍囊胚移植的臨床妊娠率和種植率為37.0%和55.1%,顯著高于新鮮囊胚移植的25.2%和36.4%。有學(xué)者[2-3]也對新鮮囊胚與解凍囊胚移植進(jìn)了比較分析，在59周期對111枚囊胚行解凍移植，臨床妊娠率和種植率分別為59.3%和43.2%，繼續(xù)妊娠率為47.5%，單胎率和雙胎率分別為60.7%和39.3%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。早期研究[4]也發(fā)現(xiàn)對于OHSS高危患者，容易成功培養(yǎng)出高質(zhì)量的囊胚，應(yīng)采用本文報道的方案實(shí)施囊胚解凍移植比較安全高效，即防止因懷孕加重遲發(fā)型OHSS，又能獲得較高的臨床妊娠結(jié)局。

正是由于解凍囊胚的成功率高，其臨床應(yīng)用日益廣泛，以后囊胚解凍移植出生的子代會越來越多，對該技術(shù)的安全性評價及妊娠婦女的圍產(chǎn)監(jiān)測研究迫在眉睫。本研究分別對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠與自然妊娠病例娩出胎盤進(jìn)行觀察比較分析，兩組胎盤面積、胎盤質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示玻璃化凍融囊胚助孕娩出胎盤大于自然妊娠。潘漪蓮等[5]回顧性分析產(chǎn)前檢查及分娩的760例輔助生育受孕雙胎孕婦(ART組)和764例自然受孕雙胎孕婦(對照組)的妊娠期并發(fā)癥及新生兒結(jié)局。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART組孕婦平均年齡(32.7±3.5)歲高于對照組(30.0±3.7)歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ART組前置胎盤、產(chǎn)后出血及妊娠期糖尿病發(fā)生率高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ART組擇期剖宮產(chǎn)率為85.52%，高于對照組(80.09%)，其急診剖宮產(chǎn)導(dǎo)致早產(chǎn)的比例低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；新生兒出生體質(zhì)量、窒息率、先天畸形發(fā)生率及病死率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。認(rèn)為ART在雙胎妊娠中會增加前置胎盤、產(chǎn)后出血及妊娠期糖尿病的發(fā)生率，但并不增加其他產(chǎn)科主要并發(fā)癥及圍產(chǎn)兒風(fēng)險，輔助生育受孕雙胎孕婦并無預(yù)防性減胎的必要。姚娟[6]也回顧分析接受輔助生育技術(shù)成功妊娠、并獲完整隨訪的1 107例孕婦(觀察組)，選擇同期出生并與觀察組母親年齡及分娩時間均相當(dāng)?shù)恼Ｊ茉心赣H1 138例作為對照組，比較兩組孕婦圍產(chǎn)期情況和兩組新生兒并發(fā)癥發(fā)生情況。觀察組的雙胎或多胎妊娠率、剖宮產(chǎn)率、早產(chǎn)率和早期先兆流產(chǎn)率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對照組的胎兒宮內(nèi)窘迫的發(fā)生率明顯高于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組的死胎率、低出生體質(zhì)量率、出生缺陷率和新生兒病死率均高于對照組，但僅有低出生體質(zhì)量率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其部分結(jié)果也支持本研究結(jié)果，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本證實(shí)。

胎盤是由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結(jié)構(gòu)，進(jìn)行物質(zhì)交換是胎盤的主要功能，胎兒通過胎盤從母血中獲得營養(yǎng)和O2，排出代謝產(chǎn)物和CO2。胎盤的合體滋養(yǎng)層能分泌數(shù)種激素，對維持妊娠起重要作用。滋養(yǎng)細(xì)胞來源于形成中胚泡的滋養(yǎng)內(nèi)胚層，是胚泡中最先分化的細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和程序性侵入是胚胎發(fā)育、胎盤形成及胎兒生長所必需的。滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異?？蓪?dǎo)致子癇前期、子癇、不明原因的流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠相關(guān)性疾病及葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨癌等妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生。已經(jīng)有研究表明[7-8]，Grb10可能對早期胚胎發(fā)育有著重要的影響，是胚胎期發(fā)育過程中多臟器表達(dá)的一個基因。小鼠行為學(xué)研究[9]中顯示印記基因Grb10的母本表達(dá)涉及胎兒成長、新陳代謝、脂肪儲存，而父本表達(dá)調(diào)控著成年小鼠的社會行為，是胚胎發(fā)育及多種生理活動中的重要基因[10-11]。對胎盤Grb10表達(dá)水平進(jìn)行分析可以反應(yīng)子代生長發(fā)育安全性[12-13]。本研究首次經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色后，發(fā)現(xiàn)玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層細(xì)胞均有不同程度的Grb10表達(dá)。兩組胎盤組織Grb10蛋白在表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、免疫組織化學(xué)評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤組織中Grb10在轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤組織中Grb10蛋白質(zhì)表達(dá)水平組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示囊胚培養(yǎng)與凍融移植尚未對胎盤Grb10的表達(dá)產(chǎn)生影響。人類印記基因Grb10在胚胎形成時期，由母方表達(dá)，而在胎兒形成后，腦中為父本優(yōu)先表達(dá)，母方等位基因在周圍組織和器官中表達(dá)。囊胚培養(yǎng)與凍融移植對胎盤Grb10等印記基因[14]表觀遺傳修飾方面是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

[1]Zhu D,Zhang J,Cao S,et al.Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles-time for a new embryo transfer strategy?[J].Fertil Steril,2011,95:1691-1695.

[2]Ku PY,Lee RK,Lin SY,et al.Comparison of the clinical outcomes between fresh blastocyst and vitrified-thawed blastocyst transfer[J].J Assist Reprod Genet,2012,29:1353-1356.

[3]Hong SW,Sepilian V,Chung HM,et al.Cryopreserved human blastocysts after vitrification result in excellent implantation and clinical pregnancy rates[J].Fertil Steril,2009,92:2062-2064.

[4]Lin DL,Jing R,Cairong C,et al.Frozen two day 3 embryos and subsequently produced blastocysts by vitrification:advantages for IVF/ICSI patients at high risk of ovarian hyperstimulation syndrome[J].Int J Clin Exp Med,2016,9(3):6986-6999.

[5]潘漪蓮,張艷,陸海茜,等.輔助生殖與自然受孕雙胎妊娠圍產(chǎn)結(jié)局比較-附1524例臨床分析[J].生殖與避孕,2015,35(10):724-729.

[6]姚娟.輔助生育技術(shù)胎兒的圍產(chǎn)期結(jié)局研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究,2014(14):48-49.

[7]Deng Y,Zhang M,Riedel H.Mitogenic roles of Gab1 and Grb10 as direct cellular partners in the regulation of MAP kinase signaling[J].J Cell Bioc,2008,105(5):1172-1182.

[8]Monami G,Emiliozzi V,Morrione A.Grb10/Nedd4-mediated multiubiquitination of the insulin-like growth factor receptor regulates receptor internalization[J].J Cell Physiol,2008,216(2):426-437.

[9]劉齊,王燕,陳巖,等.Grb10基因在小鼠胚期特異性表達(dá)分析[J].遺傳,2009,31(7):732-740.

[10]Kim M,Semple I,Kim B,et al.Drosophila Gyf/GRB10 interacting GYF protein is an autophagy regulator that controls neuron and muscle homeostasis[J].Autophagy 2015,11(8):1358-1372.

[11]Mroue R,Huang B,Braunstein S,et al.Correction:Monoallelic Loss of the Imprinted Gene Grb10 Promotes Tumor Formation in Irradiated Nf1+/-Mice[J].PLoS Genet,2015,11(6):e1005327.

[12]Mukhopadhyay A,Ravikumar G,Dwarkanath P,et al.Placental expression of the insulin receptor binding protein GRB10:Relation to human fetoplacental growth and fetal gender[J].Placenta,2015,36(11):1225-1230.

[13]Adnani L,Langevin LM,Gautier E,et al.Zac1 regulates the differentiation and migration of neocortical neurons via pac1[J].J Neurosci,2015,35(39):13430-13447.

[14]Bretz CL,Langohr IM,Lee S,et al.Epigenetic instability at imprinting control regions in a Kras(G12D)-induced T-cell neoplasm[J].Epigenetics,2015,10(12):1111-1120.

Placental Grb10 expression analysis for evaluation of security for blastocyst vitrification*

LinDianliang1,QuanSong2△,KangYuefan1,YiJinsong1,YuAili1,LinYuan1

(1.HumanAssistedReproductiveResearchUnit,FujianProvincialMaternityandChildren′sHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou,Fujian350001,China;2.CenterforReproductiveMedicine,DepartmentofObstetricsandGynecology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To analyze the expression of the placenta Grb10 from women conceived by transferred thawed blastocyst,and to evaluate the security of blastocysts vitrification.Methods A cross-sectional study was performed in the Department of Obstetrics and Gynecology of Fujian Provincial Maternity and Children′s Hospital from January 2012 to May 2014,50 women conceived by transferring thawing blastocyst and 50 natural pregnancy control women were enrolled in this study.The expression of Grb10 protein was detected by immunohistochemistry and Western blot,and the expression of Grb10 mRNA was detected by Real-time PCR method.Results Comparison of two cases of gestational age, gestational age, fetal sex, fetal body weight, body length, head circumference, abdominal circumference,there were no significant differences(P>0.05),comparison of placental area, placental weight,the difference was statistically significant(P<0.05).Real-time PCR and Western blot results showed that,there was no significant difference in the expression of Grb10 mRNA and protein between the two groups(P>0.05).Conclusion Blastocysts vitrification may increase the area and quality of delivery of placenta,however,there was no significant change in the expression of Grb10 in placenta.

blastula;vitrification;placenta;Grb10

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.001

福建省自然科學(xué)基金(2014J01277)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013-ZQN-JC-7)；福建省婦幼保健院科研基金(閩婦幼13-08,13-09,10-01)。 作者簡介：林典梁(1973-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事人類輔助生殖技術(shù)研究。△

，E-mail:quansong@smu.edu.cn。

R715

A

1671-8348(2017)11-1441-04

2016-11-11

2017-01-27)