陳遠(yuǎn)東,盧紅艷,常 明,單繼艷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,江蘇鎮(zhèn)江 212001)

論著·基礎(chǔ)研究

低聚半乳糖對(duì)早產(chǎn)大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用*

陳遠(yuǎn)東,盧紅艷△,常 明,單繼艷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 探討低聚半乳糖(GOS)對(duì)早產(chǎn)大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。方法 早產(chǎn)新生大鼠分為GOS組和對(duì)照組，GOS組每天滴管喂養(yǎng)GOS 4 g/kg，共14 d。于喂養(yǎng)GOS后7 d 和14 d，觀(guān)察大鼠一般情況并稱(chēng)質(zhì)量，同時(shí)取大鼠直腸末端糞便，行雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌及腸球菌培養(yǎng)并行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果 GOS組與對(duì)照組在給藥期間均正常生長(zhǎng)，精神狀態(tài)等未見(jiàn)異常。與對(duì)照組比較，GOS組體質(zhì)量增長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，使用GOS 7 d 時(shí)，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌及腸球菌與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。使用GOS 14 d后，大鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌較對(duì)照組明顯增加，而腸桿菌、腸球菌明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 低聚半乳糖可促進(jìn)早產(chǎn)鼠雙歧桿菌和乳酸桿菌增長(zhǎng)，抑制腸桿菌及腸球菌生長(zhǎng)，從而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。

低聚半乳糖；早產(chǎn)大鼠；腸道菌群

腸道菌群與人類(lèi)健康密切相關(guān)。早產(chǎn)兒生后受多種因素影響使腸道菌群定植延遲，多樣性豐度減少，達(dá)優(yōu)勢(shì)化時(shí)間延遲，短期有增加感染和炎癥進(jìn)程風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期甚至導(dǎo)致代謝綜合征、特應(yīng)質(zhì)及神經(jīng)-認(rèn)知發(fā)育異常[1-3]。因此，腸道菌群的穩(wěn)定是保障早產(chǎn)兒健康的第1道防線(xiàn)。為盡早建立完善的腸道菌群環(huán)境，可能需要進(jìn)行一定的營(yíng)養(yǎng)手段干預(yù)和調(diào)控。低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，動(dòng)物乳汁中存在微量GOS，但人乳汁中GOS含量較多[4]。有研究表明，短鏈GOS和長(zhǎng)鏈低聚果糖的益生元混合體能夠促進(jìn)人工喂養(yǎng)早產(chǎn)兒腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖，同時(shí)抑制銅綠假單孢菌、腸桿菌、克雷伯桿菌、變形桿菌、B族鏈球菌及梭狀芽胞桿菌等致病菌生長(zhǎng)[5]。新生兒時(shí)期是腸道菌群定植和建立健康腸道微生態(tài)的關(guān)鍵時(shí)期。本研究通過(guò)觀(guān)察GOS早期干預(yù)對(duì)早產(chǎn)新生大鼠腸道菌群的影響，探討GOS在早產(chǎn)兒中的益生元效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取清潔級(jí)SD雌鼠體質(zhì)量200～220 g，雄鼠體質(zhì)量220～250 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；GOS購(gòu)自保齡寶生物股份有限公司，雙歧桿菌培養(yǎng)基(BBL)、乳酸桿菌培養(yǎng)基(MRS)、腸桿菌培養(yǎng)基(EMB) 及腸球菌培養(yǎng)基均購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD大鼠按雌雄比3∶1合籠交配，次日晨取雌鼠陰道分泌物涂片，鏡檢見(jiàn)精子記為妊娠第1天。將受孕21 d(預(yù)產(chǎn)期22 d)的母鼠行剖宮產(chǎn)，娩出的新生SD大鼠作為早產(chǎn)鼠。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)12～24 h，分為GOS組和對(duì)照組，每組各8只，雌雄不限。GOS組早產(chǎn)鼠每天滴管喂養(yǎng)GOS(4 g/kg)，共14 d，余處理同對(duì)照組。早產(chǎn)鼠和母鼠同舍飼養(yǎng)，采用隨母哺乳方式，根據(jù)需要自由哺乳。對(duì)照組與GOS組早產(chǎn)大鼠在生后均正常生長(zhǎng)，精神狀態(tài)等未見(jiàn)異常。

1.2.2 糞樣采集與菌落培養(yǎng) 于喂養(yǎng)GOS后7 d和14 d，晨飼前刮取早產(chǎn)鼠直腸末端糞便，裝入滅菌后的離心管，迅速送回實(shí)驗(yàn)室。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.05 g糞樣，用生理鹽水等比稀釋到10∶1～10∶6不同滴度( 根據(jù)培養(yǎng)后的菌落密度調(diào)整)。雙歧桿菌及乳酸桿菌接種稀釋度約10∶5～10∶6，腸桿菌及腸球菌稀釋度約10∶3。每個(gè)滴度取200 μL，在準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基上涂菌。每個(gè)稀釋濃度涂3個(gè)培養(yǎng)皿。BBL 和MRS 平皿于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，EMB 和腸球菌平皿移至常規(guī)培養(yǎng)箱，有氧環(huán)境37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.3 大便菌群鑒定及菌落計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后，挑取典型菌落直接涂片染色鏡檢并應(yīng)用生化鑒定管進(jìn)行細(xì)菌鑒定。以菌落形態(tài)、革蘭染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算出每克濕便中的菌數(shù)，取對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以1 g(CFU/g)表示，即每g糞便標(biāo)本的菌落形成單位(CFU)的對(duì)數(shù)值(1 g)。雙歧桿菌為鏡檢革蘭陽(yáng)性菌(G+)、無(wú)芽孢、形態(tài)不規(guī)則、過(guò)氧化氫酶陰性的所有菌落；乳酸桿菌為鏡檢G+、形態(tài)規(guī)則、無(wú)芽胞的所有菌落；腸桿菌為鏡檢革蘭陰性菌(G-)所有菌落；腸球菌為明顯黑色暈圈，鏡檢G+球菌所有菌落。

2 結(jié) 果

2.1 GOS對(duì)早產(chǎn)大鼠體質(zhì)量的影響 對(duì)照組與GOS組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)在喂服GOS前及喂服GOS后7、14 d，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 GOS對(duì)早產(chǎn)大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 GOS 對(duì)早產(chǎn)大鼠腸道菌群的影響 與對(duì)照組相比，GOS組使用GOS后7 d，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌及腸球菌生長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。使用GOS后14 d，大鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌較對(duì)照組明顯增加，而腸桿菌、腸球菌明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 GOS對(duì)早產(chǎn)新生大鼠腸道菌群的影響

3 討 論

人體消化道正常菌群包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌和擬桿菌屬等[6]。雙歧桿菌、乳酸桿菌是人腸道中有益菌的代表，腸道益生菌可使碳水化合物分解產(chǎn)生多種有機(jī)酸，降低腸道pH值，競(jìng)爭(zhēng)性抑制腸道內(nèi)有害菌增殖，減少腐敗物產(chǎn)生等發(fā)揮對(duì)腸道的保護(hù)作用[7]。GOS是益生元的一種，其分子結(jié)構(gòu)一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1～7 個(gè)半乳糖基。在腸道中，GOS可作為選擇性的微生物前體，被某些細(xì)菌的β-半乳糖苷酶水解為葡萄糖和半乳糖，作為細(xì)菌復(fù)制與增殖的碳源，從而影響腸道菌群平衡。有研究報(bào)道，初生犢牛飼喂GOS 可影響腸道菌群平衡，使雙歧桿菌成為腸道優(yōu)勢(shì)菌[8]。采用傳統(tǒng)體外培養(yǎng)與體內(nèi)試驗(yàn)方法，以調(diào)節(jié)嬰兒腸道有益菌群為目的，李艷莉等[9]評(píng)價(jià)GOS的益生功能，發(fā)現(xiàn)GOS對(duì)腸道有益菌有較好的增殖作用，能有效調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，這些功能可能與腸桿菌、腸球菌等病原菌不能利用GOS，而雙歧桿菌等有益菌可利用GOS 作為自身增殖的碳源，競(jìng)爭(zhēng)性阻止病原菌的定植有關(guān)。盡管有關(guān)GOS對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用已有較多研究，但在早產(chǎn)兒中的作用尚不十分明確。

早產(chǎn)兒由于胃腸功能不成熟，出生體質(zhì)量低，抗生素應(yīng)用，管飼喂養(yǎng)，重癥監(jiān)護(hù)環(huán)境及缺乏母乳喂養(yǎng)等原因，使早產(chǎn)兒腸道菌群定植延遲，多樣性豐度顯著減少，特別是早產(chǎn)兒抗生素使用，建立了以需氧菌為基礎(chǔ)的不健康腸道菌群，這些不僅影響了早產(chǎn)兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的攝取,而且影響了腸道及全身免疫系統(tǒng)的成熟,可能出現(xiàn)過(guò)敏,甚至出現(xiàn)壞死性小腸結(jié)腸炎[10]。因此，維持腸道菌群平衡，對(duì)早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GOS組使用GOS后7 d，對(duì)腸道菌群影響不明顯，這可能與早產(chǎn)兒腸道菌群建立較晚及GOS療程不足有關(guān)。使用GOS后14 d，大鼠糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌較對(duì)照組明顯增加，而腸桿菌、腸球菌明顯減少，提示GOS可有效發(fā)揮對(duì)早產(chǎn)鼠雙歧桿菌和乳酸菌的增殖作用，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，使腸道益生菌成為腸道優(yōu)勢(shì)菌。本研究中，盡管發(fā)現(xiàn)GOS組體質(zhì)量較對(duì)照組稍有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明GOS對(duì)早產(chǎn)大鼠體質(zhì)量增加可能無(wú)明顯影響。但有研究發(fā)現(xiàn)，GOS不僅可調(diào)節(jié)腸道菌群，還可改善應(yīng)激大鼠腸道黏膜屏障功能，對(duì)小鼠有免疫增強(qiáng)作用，但對(duì)早產(chǎn)大鼠腸道屏障及免疫功能影響尚不明確[11-12]。

腸道微生物區(qū)系的早期發(fā)育很大程度上依賴(lài)于攝取的食物。嬰兒體內(nèi)雙歧桿菌菌群的建立，也依賴(lài)于母乳中的GOS。動(dòng)物乳汁中存在微量GOS，而很多早產(chǎn)兒由于種種原因，不能母乳喂養(yǎng)只能配方奶喂養(yǎng)，因此，給早產(chǎn)兒配方奶中添加GOS可較好地模擬母乳對(duì)腸道的有益作用，但這仍需進(jìn)一步研究。

[1]Morowitz MJ,Denef VJ,Costello EK,et al.Strain-resolved community genomic analysis of gut microbial colonization in a premature infant[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(3):1128-1133.

[2]Arboleya S,Solís G,Fernández N,et al.Facultative to strict anaerobes ratio in the preterm infant microbiota:a target for intervention?[J].Gut Microbes,2012,3(6):583-588.

[3]Unger S,Stintzi A,Shah P,et al.Gut microbiota of the very-low-birth-weight infant[J].Pediatr Res,2015,77(1/2):205-213.

[4]Musilova S,Rada V,Marounek M,et al.Prebiotic effects of a novel combination of galactooligosaccharides and maltodextrins[J].J Med Food,2015,18(6):685-689.

[5]Knol J,Boehm G,Lidestri M,et al.Increase of faecal bifidobacteria due to dietary oligosaccharides induces a reduction of clinically relevant pathogen germs in the faeces of formula-fed preterm infants[J].Acta Paediatr Suppl,2005,94(449):31-33.

[6]Romano-Keeler J,Moore DJ,Wang C,et al.Early Life establishment of site-specific microbial communities in the gut[J].Gut Microbes,2014,5(2):192-201.

[7]Malmuthuge N,Griebel PJ,Guan LL.The gut microbiome and Its potential role in the development and function of newborn calf gastrointestinal tract[J].Nature,2015,2(4814):459-460.

[8]王智航，姜成哲，崔明勛，等.低聚半乳糖對(duì)延邊黃牛犢牛糞樣菌群、血液指標(biāo)及生長(zhǎng)性能的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(7)：1247-1252.

[9]李艷莉，李倩，霍貴成.低聚果糖和低聚半乳糖的腸道益生功能研究[J].食品工業(yè)，2012，33(8)：73-76.

[10]Dardas M,Gill SR,Grier A,et al.The impact of postnatal antibiotics on the preterm intestinal microbiome[J].Pediatr Res,2014,76(2):150-158.

[11]謝婷，夏金榮，高峻，等.低聚半乳糖對(duì)應(yīng)激大鼠腸黏膜屏障功能的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(1)：55-60.

[12]鄭珊，杜宏舉，馬玲，等.低聚半乳糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].首都公共衛(wèi)生，2013，7(4)：163-165.

Effects of galactooligosaccharide on the intestinal flora in premature rats*

ChenYuandong,LuHongyan△,ChangMing,ShanJiYan

(DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To explore the effects of galactooligosaccharide on the intestinal flora in premature rats.Methods Premature Sprague-Dawley rats were randomly divided into GOS group and control group.Premature rats in GOS group were feeding with GOS according 4 g/kg by dropper for 14 d.At 7 d and 14 d after feeding,the mental state and weight of rats were observed and recorded,the fresh feces in terminal rectum were collected to culture and count the number of colonies of bifidobacteria,lactobacillus,enterobacteria and enterococcus.Results Rats in GOS and the control group were normal growth during the administration period,mental state was not abnormal.Compared with the same time point of the control group,there was no significant difference in weight gain between the GOS group(P>0.05).After feeding GOS for 7 d,there was no statistically significant difference between the number of colonies of bifidobacteria,lactobacillus,enterobacteria and enterococcus (P>0.05).After feeding GOS for 14 d,the number of colonies of bifidobacteria and lactobacillus increased significantly(P<0.05),while the number of enterobacteria and enterococcus decreased significantly(P<0.05).Conclusion Galactooligosaccharide could promote the proliferation of bifidobacterium and lactobacillus,inhibit the growth and reproduction of enterobacteria and enterococcus,so regulate the balance of intestinal flora.

galacto oligosaccharide;preterm rats;intestinal flora

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.003

江蘇省臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)項(xiàng)基金(BL2012058)；江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)項(xiàng)基金(JDLCZX004)。 作者簡(jiǎn)介：陳遠(yuǎn)東(1969-)，副研究員，碩士，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究工作?！?/p>

，E-mail:lhy5154@163.com。

R153.2

A

1671-8348(2017)08-1015-02

2016-07-19

2016-09-17)