時(shí)永勝 胡錫階 周單華 萬衛(wèi)紅 余 艦 章 濤 劉祖林余麗梅＊

1．遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（563003）；2．遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)鑒定中心

AMEL基因座（amelogeni，AMEL牙釉基因座）是法醫(yī)學(xué)在進(jìn)行親子鑒定和個(gè)體識(shí)別中性別確認(rèn)時(shí)常用的基因座，是X、Y染色體上的同源染色體基因，位于X染色體的Xp22．1－Xp22．3和Y染色體的Yp11．2，編碼牙釉質(zhì)蛋白［1］。不同試劑盒擴(kuò)增，這一基因的產(chǎn)物長度有所不同［2］。以往采用IdentifilerTM、PowerPlex 16等不同 PCR 擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行親權(quán)鑒定時(shí)，對(duì)AMELX、AMELY等位基因座丟失進(jìn)行了 報(bào) 道［3－11］。美國 Applied Bioystems公司生產(chǎn)的人類熒光標(biāo)記短串聯(lián)序列（STR）復(fù)合擴(kuò)增檢測試劑盒（華夏白金試劑盒）是針對(duì)中國人的基因頻率變化在IdentifilerTM試劑盒基礎(chǔ)上除性別染色體STR 外，增 加 Penta E、D2S441、D22S1045、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、Penta D八個(gè)基因座，以提高親權(quán)鑒定的準(zhǔn)確性，兩種試劑盒模板DNA含量的線性范圍均為0．5～1．25ng／25 μl。但實(shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)個(gè)別微量樣本檢測時(shí)，兩種試劑盒擴(kuò)增后的測序檢測結(jié)果存在一定差異，由此可想，在遇到AMEL基因片段擴(kuò)增缺失時(shí)，也需審慎分析，為此，本研究在二聯(lián)體親權(quán)鑒定中，就華夏白金試劑盒與IdentifilerTM試劑盒檢測父親AMELX等位基因座擴(kuò)增丟失進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 對(duì)象與方法

受檢者為爭議父親（37歲，WJ2016－0552－3）和女兒（7歲，WJ2016－0552－2）。檢材為二者的EDTA－K2抗凝靜脈血，第一次檢測時(shí)采用FTA卡制血斑，華夏白金試劑盒（AB公司，美國）進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，用3500DX遺傳分析儀（AB公司，美國）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并用GeneMapper軟件進(jìn)行圖譜分析。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)用Generation Capture Column試劑盒固相提取DNA（Qiagen公司，德國），Identifiler試劑盒（ABI公司，美國）進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，3100 Avant遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，并通過Gene Scan Software V3．7 軟 件、Genotyper SoftwareV3．7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與STR基因分型。

2 結(jié)果

2．1 華夏白金和Identifiler TM試劑盒等位基因分型

華夏白金試劑盒等位基因分型結(jié)果包括24個(gè)STR基因座（表1），累積非父排除率（CPE）＞0．999 9，計(jì)算累積父權(quán)指數(shù)（CPI）為 40 242 160 823．630 1，累積相對(duì)父權(quán)機(jī)會(huì)（RCP）為0．999 999 999 975 15，支持疑父為該女兒的生物學(xué)父親。IdentifilerTM試劑盒結(jié)果除無前所述8個(gè)基因座外，其余基因座分型結(jié)果同華夏白金試劑盒等位基因分型結(jié)果，也同樣支持疑父和女兒的生物學(xué)父女關(guān)系。

2．2 AMEL基因座分型圖譜

在華夏白金試劑盒擴(kuò)增檢測圖譜中，與分型標(biāo)準(zhǔn)無比對(duì)，WJ2016－0552－3樣本 Y染色體上的AMEL基因座峰圖明顯可見（圖1），而未見X染色上的AMEL基因座峰圖。采用IdentifilerTM試劑盒擴(kuò)增圖譜（圖2）也與圖1相似，即未見爭議父X染色體的AMEL基因座峰圖，僅存在Y染色體AMEL基因座峰圖。而通常二聯(lián)體親子鑒定中，兩個(gè)試劑盒擴(kuò)增的圖譜分別如圖3（華夏白金試劑盒擴(kuò)增）、圖4（IdentifilerTM試劑盒擴(kuò)增）所示，在X、Y兩條染色體上均可見明顯的AMEL基因座峰圖。

表1 STR基因座中不同染色體上的短串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù)

圖1 華夏白金試劑盒擴(kuò)增父基因后的基因分型圖譜

圖2 Identifiler試劑盒擴(kuò)增父基因后的基因分型圖譜

圖3 華夏白金試劑盒擴(kuò)增后正常對(duì)照的X、Y染色體AMEL基因座峰

圖4 Identifiler TM試劑盒擴(kuò)增后正常對(duì)照的X、Y染色體AMEL基因座峰

2．3 熒光定量結(jié)果及比值分析

對(duì)于IdentifilerTM試劑盒擴(kuò)增樣本的分型圖譜，最大擴(kuò)增產(chǎn)物＜350bp，擴(kuò)增容易，峰高均一。對(duì)本案例進(jìn)行峰高、峰面積分析結(jié)果顯示，正常男性X／Y染色體AMEL等位基因座峰高峰面積比值約為1，疑父與正常男性的Y染色體AMEL等位基因座峰高峰面積比值也約為1。本檢案中父親X染色體沒有AMEL等位基因座峰，女兒的X染色體AMEL等位基因座峰高、峰面積均約為正常對(duì)照者的一半（表2、表3）。

表2 Identifiler TM試劑盒AMEL等位基因座熒光定量分析結(jié)果

表3 女兒與正常女性、疑父與正常男性性染色體熒光定量比值分析（%）

3 討論

檢案中華夏白金試劑盒擴(kuò)增后，AMEL基因座分型圖譜發(fā)現(xiàn)，雖然疑父Y染色體上的AMEL基因明顯可見，但出現(xiàn)了X染色體上AMEL基因丟失，與以往研究報(bào)道父親或兒子AMEL X等位基因丟失相似，所用PCR擴(kuò)增的Identifiler、Goldeneyes 20A 、GlobalFilerTM和 PowerPlex 16試劑盒不同，產(chǎn)物長度存在差異［2，11－12］，中國人群 X 染色體和 Y染色體中AMEL等位基因總突變率為0．045%，男性群體中的突變率為0．085%［12］。進(jìn)而采用Identifiler試劑盒擴(kuò)增，取得了與華夏白金試劑盒擴(kuò)增一致的AMEL基因座分型圖譜，試驗(yàn)結(jié)果也證明父親X染色體存在AMEL基因的擴(kuò)增丟失。而女兒的AMEL基因座峰高和峰面積為正常對(duì)照的一半（正常情況下與正常對(duì)照的峰高和峰面積應(yīng)大約相等），女兒的其中一條X染色體遺傳于父親，父親無峰圖，說明女兒出現(xiàn)這種峰圖的最大可能是由于在擴(kuò)增時(shí)由于引物區(qū)突變或真正缺失AMEL基因?qū)е路鍒D異常。遺憾的是后期因血樣不足，提取DNA剩余血樣送華大基因測序無法得出結(jié)果，也即無法證實(shí)AMEL基因座擴(kuò)增缺失是基因缺失，還是引物區(qū)發(fā)生變異導(dǎo)致。

AMEL X等位基因的缺失或突變會(huì)可能為X－連鎖遺傳或新發(fā)突變，可引起牙釉質(zhì)發(fā)育不全［13］。理論上疑父的AMEL基因缺失會(huì)遺傳給女兒，可能在女兒表現(xiàn)出牙釉質(zhì)發(fā)育不全的臨床表型，女兒X染色體上AMEL峰應(yīng)為單源峰，即只來源于母親。若定量分析，如克氏綜合征（XXY）的峰圖［13］，就有兩個(gè)相同的X染色體AMEL等位基因，其峰高、峰面積約為單X染色體AMEL等位基因峰圖的兩倍。正常女性AMEL基因座純合子期望峰高、峰面積應(yīng)約為雜合子的兩倍或接近兩倍［2］。

華夏白金試劑盒，因采用直擴(kuò)方式，未定量DNA濃度，受血卡上血樣厚薄差異及打血卡大小等影響，難以準(zhǔn)確進(jìn)行AMEL缺失者與正常對(duì)照者AMEL峰高、峰面積的比較分析。這也提示，在采用華夏白金試劑盒擴(kuò)增時(shí)或缺乏分型標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)情況下，若出現(xiàn)了Y染色體AMEL基因缺失的個(gè)體識(shí)別中，或采用常用華夏白金試劑對(duì)非整倍體染色體疾病進(jìn)行DNA遺傳分析檢測時(shí)，應(yīng)改用先抽提基因組DNA，定量檢測DNA含量，確保DNA濃度高于試劑盒的最低檢測線，或采用IdentifilerTM等其他試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，避免性別錯(cuò)判，或因峰高、峰面積錯(cuò)誤分析，出現(xiàn)對(duì)克氏綜合征或21－三體綜合征等病癥的遺漏。

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