孫曉澤 杜芬芬 劉愛(ài)華*

升降散對(duì)DM大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及炎癥因子的影響

孫曉澤1杜芬芬2劉愛(ài)華1*

（1河南省中醫(yī)院干部病房，鄭州450002；2河南中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生2014級(jí)，鄭州450046）

目的觀察升降散對(duì)糖尿病大鼠乳酸桿菌、腸鏈球菌及TNF-α的影響，探討其作用機(jī)制。方法鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病模型，成模大鼠分為模型對(duì)照組和治療組（拜糖平組、升降散低劑量組、升降散中劑量組、升降散高劑量組），各組按相應(yīng)藥物劑量灌胃治療6周后，采用Elisa法檢測(cè)TNF-α、INS，Realtime PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌定量測(cè)定。結(jié)果治療前，模型組空腹血糖（FBG）、TNF-α、INS及腸鏈球菌均明顯升高，乳酸桿菌數(shù)量明顯減少；治療前后，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組各指標(biāo)無(wú)明顯變化。治療后，各治療組FBG在2周、4周及6周逐漸降低，且均高于同時(shí)間正常對(duì)照組，低于同時(shí)間模型對(duì)照組（P＜0.05）；TNF-α、INS較模型對(duì)照組明顯減少，但同時(shí)高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；腸鏈球菌數(shù)量較模型對(duì)照組明顯減少，較正常對(duì)照組以拜糖平組及升降散中劑量組減少明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳酸桿菌數(shù)量較模型對(duì)照組、正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.01）。結(jié)論升降散能通過(guò)增加益生菌數(shù)量，降低致病菌數(shù)量達(dá)到調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)的目的，從而抑制炎癥狀態(tài)，降低血糖。其部分作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)整腸道菌群、抑制炎癥因子而減輕胰島素抵抗（IR），增加胰島素利用率實(shí)現(xiàn)的。

升降散；糖尿病；腸道菌群；炎癥因子；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；腹瀉

隨著大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)腸道菌群與肥胖、糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)，腸道菌群已成為代謝性疾病防控的新方向。研究表明，腸道菌群失調(diào)可誘發(fā)慢性炎癥進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗，從而導(dǎo)致糖尿病發(fā)生，但其機(jī)制尚未十分明確。Zhang等[1]運(yùn)用16Sr DNA高通量測(cè)序方法，發(fā)現(xiàn)機(jī)體代謝參數(shù)和菌群多樣性兩者間有顯著的關(guān)聯(lián)性。此為腸道菌群的結(jié)構(gòu)可調(diào)控糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究提供了證據(jù)?，F(xiàn)有關(guān)于腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致肥胖及2型糖尿病發(fā)生的研究，多數(shù)觀點(diǎn)集中認(rèn)為腸道乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的減少與糖耐量異常密切相關(guān)。中藥升降散為臨床調(diào)理脾胃氣機(jī)的常用治療大法，前期研究證實(shí)，其改善糖尿病的癥狀及降低血糖效果頗佳。本研究通過(guò)制作DM大鼠模型，觀察升降散對(duì)DM大鼠腸道菌群（乳酸桿菌、腸鏈球菌）結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)炎癥因子（TNF-α）的影響，探討其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SD雄性大鼠70只，SPF級(jí)，體重（140～160）g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：41003100002297。清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度維持在25℃左右，自由攝水。

1.2 藥品與試劑升降散藥物組成（僵蠶10 g，蟬蛻6 g，姜黃6 g，大黃3 g），藥物購(gòu)自河南省中醫(yī)院，由三九顆粒制藥提供，顆粒劑總重量為7 g；拜糖平/阿卡波糖片（德國(guó)拜耳公司）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司）；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)）Fermentas公司）；Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker（TAKARA公司）；引物合成，擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：DP328；大鼠IL-6 Elisa檢測(cè)試劑盒、大鼠INS Elisa檢測(cè)試劑盒，河南天馳生物有限公司提供，批號(hào)：CK-E30646R、CK-E30620R。

1.3 儀器血糖測(cè)定儀：穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、熒光定量PCR管（ABI）；水平電泳儀、紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

2 研究方法

2.1 動(dòng)物造模70只大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按6∶1隨機(jī)先分為造模組和正常組。正常組予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，造模組予高脂高糖高膽固醇飼料喂養(yǎng)至滿8周后，腹腔注射STZ30 mg/kg，正常組對(duì)照組注射等體積0.1 mol/L無(wú)菌枸櫞酸緩沖液。72 h后測(cè)大鼠空腹血糖（禁食8～10 h），空腹血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)為糖尿病大鼠造模成功。剔除未成模及死亡8只。

2.2 分組與給藥取50只成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、拜糖平組、升降散高、中、低劑量組。拜糖平組每日灌胃（ig）70 mg·kg-1；升降散低、中、高劑量組，每日ig升降散(0.753，1.506，3.012 g·kg-1)，模型對(duì)照組與正常組每日ig等量生理鹽水。每3天稱體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。藥物干預(yù)6周后進(jìn)行各指標(biāo)的觀察檢測(cè)。

2.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 一般情況治療期間觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲水量、尿量、體重等。

2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè)每周血糖儀測(cè)空腹血糖值；治療第6周末，10%的水合氯醛動(dòng)物麻醉后取血標(biāo)本，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、INS。

2.3.3 Realtime PCR技術(shù)測(cè)定乳酸桿菌、腸鏈球菌按試劑盒說(shuō)明書(shū)取0.2 g大鼠新鮮糞便進(jìn)行基因組DNA提取，以其為模板做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段引物lactobacillus（341bp）：lacto F：AGCAGTAGGGAATCTTCCA，lacto R：CACCGCTACACATGGAG；Enterococcus（144bp）：Enter F:CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT，Enter R:ACTCGTTGTACTTCCCATTGT。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR熒光染料，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察正常組大鼠精神狀況良好，反應(yīng)靈敏，飲食及尿量正常，毛色有光澤，體重穩(wěn)定增加。其余各組注射STZ后明顯消瘦，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神萎靡，毛色發(fā)黃無(wú)關(guān)澤等癥狀。

3.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖值的比較見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血糖值比較（n=8，x±s，mmol/L）

3.3 各組大鼠治療前后TNF-α、INS的比較見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠治療前后TNF-α、INS的比較（n=8，x±s）

3.4 乳酸桿菌、腸鏈球菌Realtime PCR定量分析見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠治療前后乳酸桿菌、腸鏈球菌的比較（n=8，x±s）

4 討論

腸道菌群做為人體最大微生態(tài)系統(tǒng)，參與并影響著人體物質(zhì)與能量代謝，目前多項(xiàng)研究表明，腸道菌群與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能為[6-9]：首先，腸道細(xì)菌可提高能量轉(zhuǎn)化效率，能將食物中宿主自身不能分解的碳水化合轉(zhuǎn)化為代謝終產(chǎn)物—短鏈脂肪酸（SC-FAs），腸道菌群失調(diào)可誘發(fā)機(jī)體內(nèi)SCFAs水平和構(gòu)成發(fā)生異常，如此腸道抗炎癥反應(yīng)能力、腦腸肽激素分泌功能等受到影響，會(huì)引起胰島細(xì)胞功能受損、胰島素抵抗的發(fā)生；其次，高脂飲食可改變腸道細(xì)菌的環(huán)境，腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致革蘭陰性菌比例的增多、腸壁通透性增加或者腸道菌群移位，通過(guò)產(chǎn)生和吸收更多的LPS，激活胰島的低度慢性炎癥，炎癥可能通過(guò)多種途徑導(dǎo)致胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損與功能障礙，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡。同時(shí)，2型糖尿病本身亦會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂，削弱腸道屏障作用，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子，促使胰島細(xì)胞功能進(jìn)一步受損，如此形成惡性循環(huán)。因此，通過(guò)調(diào)控腸道菌群的組成或許能為糖尿病的治療提供新策略。

中醫(yī)強(qiáng)調(diào)以整體論治，對(duì)此單方面的研究甚少，對(duì)其病因病機(jī)的研究散見(jiàn)于消渴病的文獻(xiàn)中。總結(jié)前人其病因的認(rèn)識(shí)大致為稟賦虛弱、飲食失節(jié)、情致失調(diào)及勞欲過(guò)度，其病機(jī)以陰虛燥熱為主流。但疾病是發(fā)展的，病因病機(jī)亦是發(fā)展的。劉愛(ài)華教授基于多年對(duì)DM臨床觀察和總結(jié)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)基本理論、繼承脾胃學(xué)家李東垣、國(guó)醫(yī)大師李振華“升清降濁”學(xué)說(shuō)，并在查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料，運(yùn)用類比、歸納、演繹多種方法，經(jīng)過(guò)較嚴(yán)密的邏輯思維過(guò)程，創(chuàng)新提出“脾失升清，濁毒下陷”之假說(shuō)，認(rèn)為DM的發(fā)病與脾胃氣機(jī)升降失常、痰濁瘀毒逆亂有關(guān)，而且認(rèn)為“脾失升清，濁毒下陷”氣機(jī)升降是根本。故用升降散，以僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃，共研細(xì)末，以黃酒、蜂蜜為引導(dǎo)，蟬蛻、僵蠶升陽(yáng)中之清陽(yáng)；片姜黃、制大黃降陰中之濁陰，則雜氣之流毒頓消矣?，F(xiàn)代藥理亦研究證實(shí)升降散具有抗炎、抗病毒、抗過(guò)敏、解痙，利膽，抗驚厥，調(diào)節(jié)免疫等功能[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：治療前，模型組FBG、TNF-α、INS及腸鏈球菌均明顯升高，乳酸桿菌數(shù)量明顯減少。治療前后，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組各指標(biāo)無(wú)明顯變化。治療后，各治療組乳酸桿菌量較模型對(duì)照組、正常對(duì)照組明顯升高，腸鏈球菌量較模型對(duì)照組明顯減少，較正常對(duì)照組以拜糖平組及升降散中劑量減少明顯；TNF-α、INS較模型對(duì)照組明顯減少，但同時(shí)高于正常對(duì)照組；FBG在2周、4周及6周逐漸降低，但均高于同時(shí)間正常對(duì)照組，低于同時(shí)間模型對(duì)照組。由此推測(cè)，升降散能通過(guò)增加益生菌數(shù)量，降低致病菌數(shù)量達(dá)到調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)的目的，從而抑制炎癥狀態(tài)，減輕胰島素抵抗（IR），增加胰島素利用率而降低血糖。

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Effects of Shengjiang Powder on Intestinal Flora Structure Change and Inflammation Factor In DM Rats

SUN Xiaoze1,DU Fenfen2,LIU Aihua1
(1.The VIP Ward,Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 4500021,China; 2.Grade 2014 Graduate,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 4500046,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Shengjiang powder on intestinal flora structure change and inflammation factor in DM rats,and to explore its action mechanism.MethodsThe model rats of DM were established by injecting streptozotosin,and then they were randomly divided into model control group and treatment group(acarbose group,groups of low,medium,high dose of Shengjiang powder).After the treatment for 6 weeks,Elisa method was used to detect TNF-α,INS,Realtime PCR technology for quantitative determination of bacteria.ResultsBefore treatment,the FBG,TNF-α,INS and Enterococcus of the model group were significantly increased,and the lactobacillus quantity of the model group decreased significantly.The indexes of the normal control group and model control group had no significant change before and after treatment.After treatment,FBG of the treatment groups in 2 weeks,4 weeks and 6 weeks were gradually decreased,which was higher than that of the normal control group,and which was lower than that of the model group and the control group at the same time(P＜0.05).The TNF-α and INS quantity of the treatment group decreased significantly comparing with model control group,but at the same time,which was higher than that of the normal control group(P＜0.05).The Enterococcus quantity of the treatment groups decreased significantly compared with model control group,but the acarbose group and medium group of Shengjiang powder decreased significantly comparing with normal control group.The lactobacillus quantity of the treatment groups increased significantly comparing with model group and normal control group(P＜0.01).ConclusionShengjiang powder can spread by increasing the number of probiotics,reducing the number of pathogenic bacteria to adjust the structure of intestinal flora,thus inhibiting the inflammatory state to reduce FBG.Some of its mechanism may be through adjusting the intestinal flora,inhibiting inflammatory factor to insulin resistance(IR),increase the utilization rate of insulin.

Shengjiang powder;DM rats;intestinal flora;inflammation factor;animal experiment;diarrhoea

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.08.056

1672-2779（2017）-08-0135-03

張文娟 本文校對(duì)：王會(huì)喜

2016-12-13）

*通訊作者：liuaihua666888@sina.com