鄧奧宇，關(guān)統(tǒng)偉，王鵬昊，李智強，向慧平，趙順先，張習(xí)超

（1.西華大學(xué)微生物研究所/食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039；2.成都華宏生物科技有限公司，四川 成都 611833）

堆肥中木質(zhì)素降解細菌MZ-9的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

鄧奧宇1，關(guān)統(tǒng)偉1，王鵬昊1，李智強2，向慧平1，趙順先1，張習(xí)超1

（1.西華大學(xué)微生物研究所/食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039；2.成都華宏生物科技有限公司，四川 成都 611833）

在堆肥中依次采用鐵氰化鉀顯色、愈創(chuàng)木酚顯色、苯胺藍（Azure-B）退色圈試驗以及液體發(fā)酵驗證試驗測得漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）的活性分別高達9.53 U/mL、21.56 U/mL，木質(zhì)素降解率達20.32%，從而篩選到一株高活性木質(zhì)素降解菌株MZ-9。生理生化試驗及16S rDNA序列分析表明，菌株MZ-9屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）相似性為99.2%。產(chǎn)酶條件試驗表明，當pH值8.0、培養(yǎng)溫度37℃、接種量8%、培養(yǎng)時間6 d時，菌株MZ-9的Lac、MnP活性最高，此時木質(zhì)素降解率為20.51%。因此，菌株MZ-9是一株優(yōu)良的木質(zhì)素降解菌株，在木質(zhì)素降解方面具有很好的開發(fā)利用價值，可為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的菌種資源支撐。

堆肥；地衣芽孢桿菌；漆酶（Lac）活性；錳過氧化物酶（MnP）活性；木質(zhì)素；生物降解

隨著社會經(jīng)濟和人口增長，農(nóng)業(yè)種植以及種植過程中產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)固體廢物也在不斷增長；農(nóng)業(yè)固體廢物的堆肥化周期長的主要原因是堆體中大多是作物秸稈，其中木質(zhì)素又是作物秸稈的主要組分。木質(zhì)素是一種存在于大部分陸地植物中、主要由3種苯基丙烷類單體通過無規(guī)則交聯(lián)聚合形成的多酚類聚合物［1］，大約占陸地植物生物量的1/3，該聚合物以共價鍵和非共價鍵相互結(jié)合，具有完整堅硬的外殼，很難被微生物降解，成為限制堆肥腐熟的關(guān)鍵因素。然而，我國每年各類農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達20億～30億t，約占全世界總產(chǎn)量的20%～30%［2］。秸稈是一種寶貴的可再生資源，是我國發(fā)展農(nóng)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［3］，但由于其結(jié)構(gòu)致密、難以被微生物降解，使得我國農(nóng)村秸稈資源長期處于高消耗、高污染、低產(chǎn)出的狀況［4］。相當一部分農(nóng)作物秸稈被棄置或焚燒，沒有得到合理開發(fā)利用，造成了資源浪費和環(huán)境污染，可見，篩選高效降解木質(zhì)素的菌種是目前生物質(zhì)降解的重要研究方向之一［5］。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于木質(zhì)素降解菌的報道很多，但大部分研究集中在真菌對木質(zhì)素的降解上，在有效利用細菌加快木質(zhì)素腐熟方面的報道很少［6］。除真菌外，細菌也是木質(zhì)素生物降解過程中一個重要參與者［7］，如印度的一個研究團隊從造紙廢水中分離出10余株具有木質(zhì)纖維素降解能力的細菌，在應(yīng)用于造紙黑液處理時都展現(xiàn)出了良好效果。研究者們還從造紙廢水或森林土壤中篩選鑒定出不同種屬的細菌，如Klebsiella sp. BRL6-2、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Bacillus sp.等，初步證實它們具有打開木質(zhì)素聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的功能［8-10］。然而，21世紀以前，大多數(shù)研究表明細菌降解木質(zhì)素的能力比真菌差，可是由于細菌來源廣泛、生長快速、易于大規(guī)模應(yīng)用，被認為在木質(zhì)素的生物降解過程中充當著輔助真菌降解的重要作用［11］，并且木質(zhì)素的降解是個復(fù)雜的環(huán)境，需要生物具有較強的適應(yīng)性及多樣化的功能，才能在復(fù)雜環(huán)境中發(fā)揮協(xié)同作用［12］，因此高效木質(zhì)素降解細菌的挖掘具有重要研究意義。本研究希望從堆肥中篩選出高活性木質(zhì)素降解細菌，與真菌配合降解秸稈，提高秸稈資源的利用率，開發(fā)商業(yè)化的生物技術(shù)應(yīng)用，并對其相關(guān)酶學(xué)和生物學(xué)特性展開研究，為開發(fā)具有實際應(yīng)用價值的木質(zhì)纖維素生物降解技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品為成都華宏生物科技有限公司生產(chǎn)基地中的堆肥。

主要儀器設(shè)備及試劑：電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)）、渦旋振蕩儀（北京金紫光科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、雙定時電泳儀（北京市六一儀器廠生產(chǎn)）、低溫離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）。瓊脂、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；苯胺藍、鐵氰化鉀、愈創(chuàng)木酚、乙酸鈉、乙酸、乳酸鈉、硫酸錳、硫酸亞鐵銨、重鉻酸鉀、氯化鋇、（NH4）2SO4、NaCl、KH2PO4由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

主要培養(yǎng)基：（1）LA培養(yǎng)基：瓊脂20 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；（2）篩選培養(yǎng)基：瓊脂20 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，每100 mL含鐵氰化鉀0.15 g，pH 7.0；（3）LA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：LA培養(yǎng)基中加入0.04%的愈創(chuàng)木酚；（4）LA-苯胺藍培養(yǎng)基：LA培養(yǎng)基中加入0.1 g/L苯胺藍。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解木質(zhì)素菌株篩選試驗 （1）菌株初篩：取5 g樣品放入裝有100 mL無菌水的三角瓶中浸泡低速震蕩12 h，然后取樣品水樣梯度稀釋10-3涂布于篩選培養(yǎng)基上，恒溫37℃培養(yǎng)3～4 d，產(chǎn)生藍色變色圈的為陽性菌落。（2）LA-愈創(chuàng)木酚平板顯色：采用愈創(chuàng)木酚平板顯色法，用無菌接種環(huán)將分離純化的菌種點種于LA-愈創(chuàng)木酚固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，產(chǎn)生棕紅色變色圈的為陽性菌落，即可得產(chǎn)漆酶（Laccase，Lac）的菌株［13］。（3）LA-苯胺藍培養(yǎng)基平板退色：采用苯胺藍平板水解透明圈法，用無菌接種環(huán)將分離純化的菌種點接于LA-苯胺藍固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，產(chǎn)生透明圈的為陽性菌落，即可得產(chǎn)錳過氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP）的菌株［14］。

1.2.2 液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗 將1.2.1中篩選出的菌株進行液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，將活化的菌液接種于300 mL LA液體培養(yǎng)基中，接種量5%，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)；3 d后向裝有300 mL菌液的錐形瓶中加入粉碎的玉米秸稈10 g，振蕩3 d后開始取樣檢測。每隔2 d取樣1次，分別測定發(fā)酵液中Lac和MnP的活性以及木質(zhì)素含量。粗酶液制備方法如下：取1.5 mL菌液，于低溫離心機4℃下6 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。其中，Lac、MnP的活性測定參照文獻［15-16］，木質(zhì)素含量的測定和計算參照文獻［17］。

1.2.3 菌株鑒定試驗 （1）參照《伯杰細菌鑒定手冊》［18］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］對細菌進行耐鹽性、pH生長范圍、溫度生長范圍、產(chǎn)酸、酶學(xué)以及其他生理生化試驗。（2）選擇細菌通用引物，Eμ27F：（Forwardprimer， 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1490R （Reverse primer，5’-GGTTACCTTFTTACFAC GACTT-3’）。PCR反應(yīng)條件為：95℃、4 min；95℃、60 s；56℃、60 s；72℃、120 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。PCR產(chǎn)物純化按照OMEGA公司E.Z.N.Z.TM Gel Extrac-tion Kit試劑盒說明的步驟進行。純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，然后用BLAST程序?qū)⑺鶞y序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析。選擇相應(yīng)參比菌株序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產(chǎn)酶條件研究試驗 經(jīng)過前期試驗并結(jié)合文獻［11］發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素酶活性的主要影響因素為pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間，因此，本試驗采用液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，研究以上4個因素對產(chǎn)酶的影響，探索最佳產(chǎn)酶條件。pH值設(shè)5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養(yǎng)溫度設(shè)27、32、37、42、47、52℃，接種量設(shè)2%、4%、6%、8%、10%，培養(yǎng)時間設(shè)2、4、6、8、10、12、14 d。單因素試驗后，分別以MnP、Lac的活性為考核指標，按L9（34）正交因素水平表（表1）進行試驗，選出最優(yōu)組合，將活化的菌液接種于300 mL LA液體培養(yǎng)基中，按照最佳組合的培養(yǎng)條件振蕩培養(yǎng)，3 d后向裝有300 mL菌液的錐形瓶中加入粉碎的玉米秸稈10 g，14 d后結(jié)束振蕩并測定木質(zhì)素降解率。

表1 影響木質(zhì)素酶活性因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 降解木質(zhì)素菌株篩選結(jié)果

2.1.1 菌株初篩 將采集的堆肥樣品經(jīng)過適當稀釋涂布平板法接種到添加有鐵氰化鉀的篩選培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，有11株菌在篩選培養(yǎng)基上呈黃綠色圈，即為陽性菌株。

2.1.2 LA-愈創(chuàng)木酚平板顯色復(fù)篩 愈創(chuàng)木酚是具有木質(zhì)素苯環(huán)結(jié)構(gòu)特征的木質(zhì)素類似物，可在菌落周圍較快地形成鮮艷而均勻的紅棕色氧化圈，且顯色圈的直徑和顏色可較好地反映Lac活性。本試驗從11株菌中進行LA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)篩選，分離到5株產(chǎn)Lac的細菌，其棕紅色變色圈直徑見表2。其中MZ-1、MZ-2、MZ-4、MZ-6、MZ-8、MZ-10不顯色，其他5株菌株顯色直徑各不相同，MZ-3顯色直徑最小，其次是MZ-5、MZ-11、MZ-7，菌株MZ-9顯色直徑最大（3.01 cm）。

表2 各株菌的LA-愈創(chuàng)木酚平板顯色試驗結(jié)果

2.1.3 LA-苯胺藍培養(yǎng)基平板退色復(fù)篩 苯胺藍脫色法對木質(zhì)素降解的錳過氧化物酶專一性強、效果明顯。將從2.1.2中篩選出的5株顯色菌進行LA-苯胺藍培養(yǎng)基平板退色試驗篩選，分離到2株產(chǎn)MnP的細菌（表3）。其中MZ-3、MZ-7、MZ-11不產(chǎn)生退色圈，菌株MZ-5退色直徑為2.34 cm、MZ-9退色直徑高達3.11 cm，因此選定菌株MZ-9為目標菌株。在某種程度上，退色圈的大小代表了菌株產(chǎn)木質(zhì)素酶能力的強弱，但還需MZ-9菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)進一步驗證MZ-9菌株的產(chǎn)漆酶（Lac）和錳過氧化物酶（MnP）的活性以及木質(zhì)素降解率。

表3 各菌株的LA-苯胺藍培養(yǎng)基平板退色試驗結(jié)果

2.2 MZ-9菌株液體發(fā)酵中的酶活性及木質(zhì)素降解特性

2.2.1 Lac活性 由圖1可知，MZ-9菌株可產(chǎn)Lac，且隨著培養(yǎng)時間的延長Lac活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)5～8 d達到產(chǎn)酶高峰期、酶活性最高可達9.53 U/mL，隨后下降較為明顯，培養(yǎng)12 d后酶活下降至穩(wěn)定?？梢姡琈Z-9具有較強的產(chǎn)Lac特性。

圖1 Lac活性變化

2.2.2 MnP活性 從圖2可以看出，MZ-9菌株可產(chǎn)MnP，且隨著培養(yǎng)時間的延長MnP活性先顯著升高后顯著下降，在培養(yǎng)6～10 d達到產(chǎn)酶高峰期、酶活性第8 d時達21.56 U/mL，隨后下降至逐漸穩(wěn)定。可見，MZ-9具有較強的產(chǎn)MnP特性。

圖2 MnP活性變化

2.2.3 木質(zhì)素含量及降解率 在菌種降解玉米秸稈過程中，大量的胞外酶可以降解外露的木質(zhì)素。圖3顯示，降解木質(zhì)素的含量先下降后趨于穩(wěn)定，菌株MZ-9木質(zhì)素降解率達到20.32%，說明MZ-9降解木質(zhì)素能力較強。綜上所述，MZ-9為降解木質(zhì)素的最佳菌株。

2.3 菌株MZ-9的鑒定結(jié)果

將MZ-9菌株的序列片段在GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，用Clustalx軟件進行同源性分析，并用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。比對結(jié)果（圖4）顯示，MZ-9菌株與Bacillus licheniformis L15相似性高達99.2%。因此，確定菌株MZ-9為地衣芽孢桿菌。

菌株MZ-9的生理生化反應(yīng)結(jié)果見表4，由表4可知，MZ-9革蘭氏染色為陽性。產(chǎn)酸、酶學(xué)、明膠水解、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、酪素水解、V-P、淀粉水解等實驗均為陽性，而卵黃卵磷脂酶實驗為陰性。該菌在NaCl 0～10%、pH 6.0～9.0、溫度20～45℃均能生長，其中NaCl 6%、pH 8.0、37℃為最適生長條件。這些生理生化特點與地衣芽孢桿菌極為相似，結(jié)合生理生化和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，初步命名該菌株為B. licheniformis MZ-9。

圖3 木質(zhì)素含量的變化

圖4 MZ-9系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 MZ-9菌株生理生化特性

圖5 pH值對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響

2.4 MZ-9菌株產(chǎn)MnP、Lac活性條件優(yōu)化試驗

2.4.1 pH值對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響 從MZ-9菌株在不同pH值培養(yǎng)基培養(yǎng)下的結(jié)果（圖5）可以看出，pH從5.0開始兩種酶的活性逐漸升高，當pH值同時達到8.0時酶活性達到最高（MnP活性33.56 U/mL、Lac活性11.53 U/mL）；之后隨著pH值的提高，木質(zhì)素酶的活性呈緩慢下降趨勢，表明木質(zhì)素酶在偏堿性條件下活性穩(wěn)定，能發(fā)揮良好的酶解作用。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響 由圖6可知，從25℃開始兩種木質(zhì)素酶的活性逐漸升高，當溫度達到37℃時酶活性最高，其中MnP活性32.13 U/mL、Lac活性9.24 U/mL；之后隨著溫度的上升酶活性呈緩慢下降趨勢，表明木質(zhì)素酶在37℃條件下活性穩(wěn)定，能發(fā)揮良好的酶解作用。

圖6 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響

2.4.3 接種量對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響 從接種量2%開始兩種酶的活性隨之逐漸升高，當接種量達到6%時酶活性最高，其中MnP活性32.51 U/mL、Lac活性10.54 U/mL；之后隨著接種量的增加酶活性呈緩慢下降趨勢（圖7），表明木質(zhì)素酶在接種量為6%的條件下活性穩(wěn)定，能發(fā)揮良好的酶解作用。

圖7 接種量對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響

2.4.4 培養(yǎng)時間對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響 圖8表明，從培養(yǎng)6 d開始兩種酶活性逐漸升高，當培養(yǎng)時間達6 d時Lac活性最高為10.23 U/mL，當培養(yǎng)時間達8 d時MnP活性達最高（32.14 U/mL），之后隨著培養(yǎng)時間的延長酶活性呈緩慢下降趨勢，表明木質(zhì)素酶在培養(yǎng)5～8 d活性穩(wěn)定，能發(fā)揮良好的酶解作用。

2.4.5 正交試驗結(jié)果 從表5可以看出，在影響MnP活性的因素中，以培養(yǎng)溫度的影響程度最大，其次是pH值和接種量，最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即pH值8.0、培養(yǎng)溫度37℃、接種量8%、培養(yǎng)時間6 d。

從表6可以看出，在影響Lac活性的因素中，培養(yǎng)時間對Lac活性的影響最大，其次是培養(yǎng)溫度和pH值，最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即pH 值8.0、培養(yǎng)溫度37℃、接種量8%、培養(yǎng)時間6 d是MZ-9的最佳產(chǎn)酶條件。

綜上所述，在影響MnP、Lac活性的因素中，培養(yǎng)時間和溫度影響力較大。將MZ-9菌株接種于pH值8.0、培養(yǎng)溫度37℃、接種量8%、培養(yǎng)時間6 d的條件下發(fā)酵，培養(yǎng)14 d后測得MZ-9木質(zhì)素的降解率可達20.51%。

圖8 培養(yǎng)時間對產(chǎn)MnP、Lac活性的影響

3 結(jié)論與討論

堆肥法是環(huán)境工程中的一種利用自然界中天然存在的或經(jīng)過人類改造的微生物對有機固體廢物的氧化、分解能力，并在一定溫度、濕度和pH值條件下使可降解有機固體廢物發(fā)生生物化學(xué)降解，形成類似腐殖質(zhì)土壤的物質(zhì)，堆肥法的產(chǎn)物稱為堆肥，堆肥可以為土壤提供大量腐殖質(zhì)和以有機狀態(tài)存在的豐富營養(yǎng)物質(zhì)［20］。例如，席北斗等［21］發(fā)現(xiàn)，堆肥中木質(zhì)素的降解微生物有放線菌和真菌，其中白腐菌是一種高效木質(zhì)素降解微生物；張曉倩等［22］研究了添加木質(zhì)素降解菌對堆肥中酶活性的影響，試驗通過在堆肥中添加微生物菌劑，利用多種微生物的協(xié)調(diào)作用提高了堆肥溫度，加快了堆肥腐熟，加速了堆料中各種有機質(zhì)的降解，從而提高了堆肥的利用率。因此，堆肥是挖掘木質(zhì)素降解菌的重要來源。戴蕓蕓等［23］發(fā)現(xiàn)，細菌生長快、結(jié)構(gòu)簡單、適宜在弱酸、弱堿條件下生長，在降解木質(zhì)纖維素方面具有潛在應(yīng)用前景，因此挖掘自然界中能降解木質(zhì)纖維素的細菌有著重要意義。本試驗通過研究堆肥中細菌對木質(zhì)素的降解，篩選出一株能有效降解木質(zhì)素的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）MZ-9，該菌降解木質(zhì)素的最佳培養(yǎng)條件為pH 8、培養(yǎng)溫度37℃、接種量8%、培養(yǎng)時間6 d時，在該條件下MZ-9菌株木質(zhì)素降解率可高達20.51%。國內(nèi)一些學(xué)者研究表明，地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等對麥麩、麥稈、稻草等木質(zhì)素的降解率最高為17.03%［24］。因此，菌株MZ-9在木質(zhì)素降解方面具有很好的開發(fā)利用價值，可為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的菌種資源支撐。然而，MZ-9菌株對木質(zhì)素的強降解作用依賴于Lac、MnP的產(chǎn)生，對有無其他關(guān)鍵酶系尚需進一步研究確定，希望利用MZ-9菌株結(jié)合真菌能開發(fā)出可商業(yè)化應(yīng)用的木質(zhì)纖維素生物降解技術(shù)，生成有價值的化工產(chǎn)品。

表5 影響MnP活性正交試驗結(jié)果

表6 影響Lac活性正交試驗結(jié)果

［1］張海峰，楊軍艷，吳建新，等. 木質(zhì)素氧化降解研究進展［J］. 有機化學(xué)，2016，36（2）：1266-1286.

［2］李丹花，喬莉娟. 堆肥中高效纖維素降解菌的篩選與鑒定［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54 （16）：59-64.

［3］劉振，劉玲，張淑敏，等. 秸稈利用循環(huán)模式的能值效率和持續(xù)發(fā)展［J］. 生態(tài)學(xué)報，2016，36 （15）：4740-4749.

［4］屈森虎，楊磊，陳媛. 木質(zhì)素降解細菌的分離與生化特性研究［J］. 環(huán)境與生活，2014（18）：160-162.

［5］熊海忠. 秸稈腐熟劑的應(yīng)用及前景展望［J］. 農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2016（2）：12-30.

［6］王垚，韓燕峰，梁宗琦. 采自武夷山高溫木質(zhì)素降解菌優(yōu)良菌株篩選及其木質(zhì)素降解效果測定［J］. 菌物學(xué)報，2016，35（10）：1169-1177.

［7］Vicuna R. Bacterial degradation of lignin ［J］. Enzyme and Microbial Technology，1988，10：646-655.

［8］Raj A，Reddy M M K，Chandra R，et al. Biodegradation of kraft-lignin by Bacillus sp. isolated from sludge of pulp and paper mill ［J］. Biodegradation，2007，18（6）：783-792.

［9］Masai E，Katayama Y，F(xiàn)ukuda M. Genetic and biochemical investigations on bacterial catabolic pathways for lignin-derived aromatic compounds ［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2007，71（1）：1-15.

［10］鮑文英，江經(jīng)緯，周云，等. 一株木質(zhì)纖維素降解菌的篩選及其全基因組分析［J］. 微生物學(xué)報，2016，56（5）：765-777.

［11］Zimmermann W. Degradation of lignin by bacteria ［J］. Journal of Biotechnology，1990，13：119-130.

［12］Kamoda S，Saburi Y. Structural and enzymatical comparison olignostilbene-α，β-dioxygenase isozymes，Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ，from Pseudomonas paucimobilis TMY1009 ［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1993，57：931-934.

［13］劉家揚，焦國寶，有小娟，等. 真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用研究進展［J］. 生物技術(shù)通報，2016，32（4）：24-33.

［14］Borneman W S，Hartley R D，Morrison W H，et al. Feruloyl and p-coumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plant cell wall degradation ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，1990，33：345-351.

［15］Cantarella G，d’Acunzo F，Galli C. Determination of laccase activity in mixed solvents：comparison between two chromogens in a spectrophotometric assay ［J］. Biotech Bioeng，2003，82：395-398.

［16］Xu J Z，Zhang J L，Hu K H，et al. The relationship betweenlignin peroxidase and manganese peroxidase production capaci-ties and cultivation periods of mushrooms ［J］. Miccrob Biotechnol，2013，6（3）：241-247.

［17］于德涵，黎莉. 重篩野生黑木耳廢渣中木質(zhì)素過氧化物酶的研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（17）：4509-4513.

［18］Buchanan R E，Gibbons N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社，1984：729-797.

［19］東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：135-138.

［20］Borneman W S，Hartley R D，Morrison W H，et al. Feruloyl and p-coumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plant cell wall degradation ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，1990，33：345-351.

［21］席北斗，劉鴻亮，白慶中，等. 堆肥中纖維素和木質(zhì)素的生物降解研究現(xiàn)狀［J］. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2002，3（3）：19-23.

［22］張曉倩，許修宏，王晶，等. 添加木質(zhì)素降解菌對堆肥中酶活性的影響［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2012，31（4）：843-847.

［23］戴蕓蕓，鐘衛(wèi)鴻. 細菌降解木質(zhì)纖維素的研究進展［J］. 化學(xué)與生物工程，2016，33（6）：11-15.

［24］燕紅，楊謙，潘忠誠. 一株地衣芽孢桿菌對稻草降解作用的研究［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2007，33（4）：360-366.

（責(zé)任編輯 張輝玲）

Screening of lignin degradation strain MZ-9 and optimization of enzyme production conditions in compost

DENG Ao-yu1，GUAN Tong-wei1，WANG Peng-hao1，LI Zhi-qiang2，XIANG Hui-ping1，ZHAO Shun-xian1，ZHANG Xi-chao1
（1. Institute of Microbiology，Xihua University/key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province，Chengdu 610039，China；2. Chengdu Huahong Biotechnology Co.，Ltd，Chengdu 611833，China）

This experiment use the potassium ferricyanide color，guaiacol color and aniline blue （Azure -B） fading circle method，and liquid fermentation experiment，measured enzyme activitives of Laccase （Lac） and Manganese Peroxidase （MnP） were as high as 9.53 U/mL，9.53 U/mL，lignin degradation rate was 20.32%，from the compost. An active strain MZ-9 is screened as a strong lignin degradation strain. Physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis showed that strain MZ-9 belonged to Bacillus and had 99.2% similar to Bacillus licheniformis. Enzyme production showed that when the pH value was 8.0，the culture temperature was 37℃，the inoculation amount was 8% and the culture time was 6 d，the Lac and MnP activities of strain MZ-9 were the highest，and the degradation rate of lignin was 20.51%. Therefore，strain MZ-9 is an excellent lignin degradation strain，has a very good development and utilization value in the lignin degradation，and can provide a reliable strain resource support for the subsequent industrial production.

compost；Bacillus licheniformis；Laccase （Lac） activity；Manganese Peroxidase （MnP） activity；lignin；biodegradation

Q93-331

A

1004-874X（2017）02-0095-09

2016-11-21

成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)項目（2015-NY02-00007-NC）；成都市高校人才創(chuàng)新服務(wù)項目（2015- RC03-00033-HZ）；成都市產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合實驗室項目（2015-YF04-00052-JH，15205206）

鄧奧宇（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：363214722@qq.com

關(guān)統(tǒng)偉（1978-），男，博士，副教授，E-mail：guantongweily@163.com

鄧奧宇，關(guān)統(tǒng)偉，王鵬昊，等.堆肥中木質(zhì)素降解細菌MZ-9的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44 （2）：95-103.