李紅偉，陳 圓，鄧丹青，劉家玲，鐘淡龍

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021）

惠陽胡須雞微衛(wèi)星多態(tài)性研究

李紅偉1，陳 圓1，鄧丹青1，劉家玲1，鐘淡龍2

（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021）

為進(jìn)一步保護(hù)和利用惠陽胡須雞遺傳資源，監(jiān)測(cè)保種場(chǎng)保種效果，隨機(jī)采集96只惠陽胡須公雞血樣，提取總DNA，選用18對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其基因片段進(jìn)行掃描，利用Pop Gen 32軟件分析掃描結(jié)果，結(jié)果表明，18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在惠陽胡須雞群中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，平均等位基因數(shù)為10.61個(gè)，平均雜合度H為0.5963，平均多態(tài)信息含量PIC為0.74。說明惠陽胡須雞保種群體具有豐富的遺傳多樣性，具有較大的選育潛力。

惠陽胡須雞；微衛(wèi)星標(biāo)記；等位基因；雜合度；多態(tài)信息含量

微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats）或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STRs），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6 bp短核苷酸重復(fù)片段首尾串聯(lián)構(gòu)成，如（CA）8、（CAC）5、（GGAT）4、（GAGA）4等。作為第二代分子標(biāo)記的代表，微衛(wèi)星具有特異性高、共顯性遺傳、多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、檢測(cè)快捷等特點(diǎn)［1］。目前在遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)研究、品種鑒別等方面有廣泛應(yīng)用［2-3］。自然界中，各種生物個(gè)體表現(xiàn)出來的遺傳變異，本質(zhì)上就是 DNA 的差異，可直接通過研究 DNA 變異程度分析各群體的遺傳結(jié)構(gòu)。因此，微衛(wèi)星多態(tài)性分析在畜禽遺傳多樣性評(píng)估、品種資源分類、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)方面發(fā)揮著重要作用［4-9］。

微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳多樣性研究中，尤其在群體遺傳學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)形成了一個(gè)較為完整的體系。通過多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)地方雞品種的等位基因頻率、基因雜合度、平均基因雜合度、多態(tài)信息含量、平均多態(tài)信息含量以及群體間遺傳距離進(jìn)行分析，從分子水平揭示地方雞品種的遺傳差異和起源關(guān)系，此策略已成功用于尼西雞［10］、鹽津?yàn)豕请u［11］、文山山地烏骨雞［12］、靈昆雞［13］等的親緣關(guān)系分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

50個(gè)慢羽和46個(gè)快羽惠陽胡須公雞的血樣隨機(jī)采自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司的惠陽胡須雞國(guó)家保種場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物選擇與合成 選擇等位基因數(shù)多、多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用莫國(guó)東等［9］根據(jù)FAO推薦的18個(gè)雞微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，分別為ADL0112、ADL0268、LEI0166、MCW0014、 MCW0020、CW0034 、MCW0037、MCW0078、MCW0098、MCW0103、MCW0111、MCW0123、MCW0183、MCW0206、MCW0216、MCW0222、MCW0248、MCW0295，合成相關(guān)引物共18對(duì)。

1.2.2 全基因組DNA提取 根據(jù)試劑盒說明抽提血樣總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及基因掃描 DNA樣送至華大基因廣州分部進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以瓊脂糖檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若電泳結(jié)果無雜帶且目的條帶明亮，則進(jìn)行基因片段掃描。

1.2.4 遺傳參數(shù)分析 根據(jù)基因掃描圖，統(tǒng)計(jì)遺傳多樣性的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用Pop Gen 32生物軟件進(jìn)行分析，獲得惠陽胡須雞群體的等位基因數(shù)、雜合度（H）及多態(tài)信息含量（PIC）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期目的片段大小一致，且每個(gè)片段的熒光帶清晰，可用于下一步基因掃描。

圖1 部分微衛(wèi)星引物擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)18對(duì)微衛(wèi)星進(jìn)行熒光標(biāo)記，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小分為8組，分批上機(jī)進(jìn)行全自動(dòng)掃描。檢測(cè)結(jié)果通過GENEMARKER導(dǎo)出峰圖，只有1個(gè)峰值的是純合子，有兩個(gè)峰值的是雜合子。由圖2可知，73號(hào)個(gè)體所用的引物是MCW0014，檢測(cè)結(jié)果只有1個(gè)峰值，是純合子，長(zhǎng)度是178bp/178 bp；由圖3可知，62號(hào)個(gè)體所用的引物是LEI0116，檢測(cè)結(jié)果有兩個(gè)峰值，是雜合子，長(zhǎng)度是345 bp/355 bp。

圖2 73號(hào)個(gè)體MCW0014微衛(wèi)標(biāo)記的基因掃描結(jié)果

圖3 62號(hào)個(gè)體LEI0116微衛(wèi)星標(biāo)記的基因掃描結(jié)果

2.2 惠陽胡須雞群體的多態(tài)性分析結(jié)果

由表1可知，本試驗(yàn)在96個(gè)惠陽胡須雞個(gè)體中共檢測(cè)到等位基因數(shù)191個(gè)，平均等位基因數(shù)為10.6個(gè)。不同微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)差異較大，最低為4個(gè)（MCW0020），最高的有16個(gè)（MCW0111、MCW0034 ）。

衡量群體遺傳變異程度的主要指標(biāo)是雜合度和多態(tài)信息含量。本試驗(yàn)多態(tài)信息含量（PIC）最高的位點(diǎn)是MCW0034（0.954），最低的位點(diǎn)是MCW0248（0.519），18個(gè)微衛(wèi)星座位多態(tài)信息含量的數(shù)值均高于0.5，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。18個(gè)微衛(wèi)星座位的雜合度最高的位點(diǎn)是MCW0111（0.891），最低的位點(diǎn)是MCW0103（0.391），除MCW0014、MCW0103兩個(gè)位點(diǎn)外，其余雜合度數(shù)值均高于0.5。

2.3 惠陽胡須雞慢羽群體與快羽群體的多態(tài)性比較

由表2可知，18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在快羽群體中，平均等位基因數(shù)為7.8個(gè)，H和PIC分別為0.646和0.721，其高度、中度多態(tài)性位點(diǎn)分別有17、1個(gè)，沒有低度多態(tài)性位點(diǎn)；而在慢羽群體中，平均等位基因數(shù)為9個(gè)，H和PIC分別為0.650和0.694，其高度、中度多態(tài)性位點(diǎn)分別有16、2個(gè)，沒有低度多態(tài)性位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究采用18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)96個(gè)惠陽胡須群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在惠陽胡須雞群中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，共檢測(cè)到等位基因191個(gè)，平均等位基因數(shù)為10.6個(gè)，與廣西東蘭烏雞［9］（平均等位基因數(shù)為5.44個(gè)）、藏雞［14］（平均等位基因數(shù)為7.25個(gè)）相比，惠陽胡須雞等位基因數(shù)明顯較多，表明惠陽胡須雞保種群的遺傳多樣性較為豐富。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)差異較大，最多達(dá)16個(gè)，最少的僅有4個(gè)，對(duì)于等位基因數(shù)少的家系，應(yīng)與等位基因數(shù)多的家系交配，以增加等位基因數(shù)。雜合度為0.891。雜合度越高，群體變異越多，該群體遺傳多樣性越豐富?；蓐柡毠u群體的平均雜合度為0.68，與藏雞［14］（0.67）相當(dāng)，比廣西東蘭烏雞［9］（0.54）、尼西雞［10］（0.63）、鹽津?yàn)豕请u［11］（0.62）高。

表1 惠陽胡須雞在18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記上的多態(tài)性參數(shù)

表2 不同羽速惠陽胡須雞的遺傳參數(shù)變異

多態(tài)信息含量（PIC）為度量微衛(wèi)星DNA座位變異程度高低的一個(gè)理想指標(biāo)。根據(jù)Vanhala等［15］確定的位點(diǎn)多態(tài)性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，若PIC＜0.25，為低度多態(tài)座位；若0.25＜PIC＜0.5，屬于中度多態(tài)座位；若微衛(wèi)星座位PIC＞0.5，指示為一高度多態(tài)座位。所選用的18個(gè)微衛(wèi)星座位都屬于高度多態(tài)座位，其平均多態(tài)信息含量為0.74，與廣西東蘭烏雞［9］（0.60）、尼西雞［10］（0.55）、鹽津?yàn)豕请u［11］（0.57）相比較高，與藏雞［14］（0.74）、 靈昆雞［13］（0.72）相當(dāng)。 惠陽胡須雞快羽和慢羽兩個(gè)群體的平均PIC均大于0.5，說明這兩個(gè)雞群體的遺傳多樣性較豐富。該結(jié)果與雜合度分析結(jié)果相吻合，表明惠陽胡須雞群體遺傳變異比較大，遺傳多樣性相當(dāng)豐富，有較大的選育潛力。

本研究對(duì)96個(gè)惠陽胡須群體的18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析表明，等位基因數(shù)多、雜合度及多態(tài)信息含量高，在分子水平上證明了廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司惠陽胡須雞國(guó)家保種場(chǎng)胡須雞群體具有豐富的遺傳多樣性，其選育潛力較高。

群體雜合度（H）指被檢測(cè)群體在該位點(diǎn)上的雜合子頻率，是各群體不同位點(diǎn)上遺傳變異的反映，是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，雜合度最高的是MCW0111座位，其

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Study on microsatellite polymorphism of male chickens in Huiyang Bearded chicken

LI Hong-wei1，CHEN Yuan1，DENG Dan-qing1，LIU Jia-ling1，ZHONG Dan-long2
（1. College of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，China；2.Guangdong Jinzhong Animal Husbandry Co.，Ltd，Huizhou 516021，China ）

In order to evaluate the status of genetic diversity in Huiyang Bearded chicken，blood from 96 male individuals was collected to extract DNA for amplifying 18 microsatellite sites by polymerase chain reaction （PCR）. Data from Fluorecence-based Genescan with the 18 microsatellite markers were analyzed by Pop Gen 32 software to calculate the allele frequency，heterozygosity，and polymorphism information content. The results showed that the average number of alleles per site，heterozygosity，polymorphism information content were 10.6，0.5963，0.73 respectively. The results indicate that there are abundant genetic diversity in Huiyang Bearded chicken.

Huiyang Bearded chicken；microsatellite marker；allele；heterozygosity；polymorphic information content

Q346+.5

A

1004-874X（2017）02-0149-05

2016-11-01

惠州市科技專項(xiàng)資金（2014B040008002）

李紅偉（1972-），男，博士，講師， E-mail：lhwcau@163.com

李紅偉，陳圓，鄧丹青，等. 惠陽胡須雞微衛(wèi)星多態(tài)性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：149-153.