馬 戎，魯 琰，顧巧玲

（1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730000）

AG490聯(lián)合DDP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

馬 戎1，魯 琰2，顧巧玲1

（1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討AG490聯(lián)合DDP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步探討JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在卵巢癌侵襲調(diào)控中的作用機(jī)制。方法 卵巢上皮癌的細(xì)胞株SKOV3用AG490、AG490+DDP處理后，再用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間對(duì)SKOV3增殖的抑制作用，并用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果（1）MTT比色試驗(yàn)：AG490處理細(xì)胞后，同一時(shí)間點(diǎn)不同組的細(xì)胞增殖率兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同時(shí)間點(diǎn)同一藥物濃度組（除對(duì)照組外）兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，用AG490處理后，24小時(shí)就可看到明顯的細(xì)胞凋亡峰，而聯(lián)合用藥組凋亡峰出現(xiàn)得更早（P＜0.05）。結(jié)論（1）AG490能夠抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖水平明顯下降，細(xì)胞增殖抑制情況隨AG490濃度的增強(qiáng)和作用時(shí)間的增加更加明顯；AG490聯(lián)合DDP效果更明顯。（2）AG490作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而聯(lián)合DDP效果更甚。（3）AG490可能是通過阻斷STAT3蛋白的激活抑制JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。（4）AG490可以明顯提高傳統(tǒng)化療藥物DDP的療效。

AG490；DDP；卵巢癌；SKOV3細(xì)胞

卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，占婦科腫瘤的25%，因卵巢位于盆腔深部，不宜早期發(fā)現(xiàn)，臨床患者初診70%～80%已是中晚期。以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)+鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌公認(rèn)的最佳初治方案，但超過50%達(dá)到完全緩解的患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，5年生存率一直徘徊在20%～40%[1]。而再次化療則要面對(duì)卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物的不敏感和產(chǎn)生耐藥性等問題，故卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥始終是治療的兩大難點(diǎn)。本研究觀察不同濃度AG490及AG490與DDP（順鉑）聯(lián)合作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞所引起的生物學(xué)效應(yīng)，主要包括細(xì)胞增殖活性、侵襲轉(zhuǎn)移的改變、凋亡以及與此相關(guān)的一些基因和蛋白質(zhì)檢測(cè)，從而研究JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選用人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞SKOV3（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)），用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，使細(xì)胞同步化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT比色試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、吹打，制成細(xì)胞懸液濃度為4× 104/ml，取3塊96孔培養(yǎng)板，每孔放細(xì)胞懸液200 μl，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分組：對(duì)照組，AG490 50 μmol/L組、AG490 100 μmol/L組、AG490 50 μmol/L+DDP 1 μg/L組、AG490 100 μmol/L+DDP 1 μg/L組，每組設(shè)8個(gè)平行孔。加藥后繼續(xù)置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于加藥后的12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)各取出一塊96孔板，小心吸去每孔的上清液，并在每孔加入200 μl無血清的RPIM-1640及10 μl 5 mg/L的MTT，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)，取出后棄上清液，每孔加200 μl DMSO，并將96孔板置于微型振蕩器上振蕩10分鐘。比色：用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度值（A值），選取波長(zhǎng)570 nm，用只加培養(yǎng)液未加細(xì)胞的空白孔進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)調(diào)零，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。增殖率的計(jì)算[2]：細(xì)胞增殖率＝1-（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100%。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制的情況，包括細(xì)胞形態(tài)的改變、數(shù)目的變化、增殖的變化，計(jì)算AG490、AG490+DDP在不同濃度、不同作用時(shí)間點(diǎn)時(shí)SKOV3細(xì)胞的增殖率。

1.2.2 流式細(xì)胞凋亡分析 波長(zhǎng)為488 nm，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于25 ml的培養(yǎng)瓶。分組：對(duì)照組、AG490 50 μmol/L組、AG490 100 μmol/L組、AG490 50 μmol/L+DDP 1 μg/L組、AG490 100 μmol/L+DDP 1 μg/L組，每組設(shè)10個(gè)平行組，分別在加藥后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)收集各組的細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)組收集的樣本數(shù)是5個(gè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3正常狀態(tài)下單層貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形。加入AG490藥物培養(yǎng)后，細(xì)胞開始出現(xiàn)圓縮，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，凋亡率增加。

2.1 AG490、AG490聯(lián)合DDP對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 顯微鏡下每日觀察各組細(xì)胞數(shù)量、大小和形態(tài)學(xué)的變化。對(duì)照組：顯微鏡下見SKOV3細(xì)胞單層生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)梭形或多角形，胞核圓形或橢圓形，胞漿透亮。經(jīng)AG490或AG490+DDP處理后，細(xì)胞胞體變圓，胞漿透亮度下降，顆粒感增強(qiáng)，部分細(xì)胞脫落呈懸浮狀，并可見細(xì)胞碎片。上述變化隨AG490作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物劑量的增加而更加顯著。

2.1.2 用MTT比色試驗(yàn)觀察SKOV3細(xì)胞增殖被抑制的情況AG490和AG490聯(lián)合DDP對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制作用在時(shí)間和濃度上比較，均存在顯著性差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 AG490單用或聯(lián)合DDP對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖率的影響

在相同作用時(shí)間，用不同濃度的AG490處理后，與對(duì)照組相比，SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，表現(xiàn)為吸光度值A(chǔ)降低，增殖率降低。同一時(shí)間點(diǎn)不同組之間的細(xì)胞增殖率兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同一藥物濃度組（除對(duì)照組外）在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 AG490單用或與DDP聯(lián)合治療在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖率的影響（s，%）

表1 AG490單用或與DDP聯(lián)合治療在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖率的影響（s，%）

組別對(duì)照組A G 4 9 0 5 0 μ m o l / L組A G 4 9 0 1 0 0 μ m o l / L組A G 4 9 0 5 0 μ m o l / L + D D P 1 μ g / L組A G 4 9 0 1 0 0 μ m o l / L + D D P 1 μ g / L組P 1 2小時(shí)4 2 . 7 7 ± 3 . 0 5 3 9 . 3 0 ± 1 . 2 0 3 5 . 0 9 ± 3 . 1 2 3 4 . 0 0 ± 1 . 9 8 3 2 . 0 1 ± 1 . 2 9＜0 . 0 5 2 4小時(shí)6 4 . 9 4 ± 3 . 1 2 3 6 . 7 5 ± 4 . 0 9 3 4 . 3 3 ± 1 . 0 5 3 2 . 5 2 ± 2 . 3 7 2 6 . 6 5 ± 2 . 8 1＜0 . 0 5 4 8小時(shí)7 9 . 2 4 ± 0 . 7 6 3 4 . 4 2 ± 3 . 9 4 3 2 . 1 2 ± 1 . 8 4 2 8 . 6 6 ± 0 . 8 1 2 1 . 4 6 ± 1 . 1 6＜0 . 0 5 P -＜0 . 0 5＜0 . 0 5＜0 . 0 5＜0 . 0 5 -

2.2 用流式細(xì)胞術(shù)觀察AG490單用或聯(lián)合DDP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

在AG490不同藥物濃度作用的12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)分別檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，并用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，AG490使SKOV3細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，S期和G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），見表2。增加AG490濃度后，24小時(shí)就可看到明顯的凋亡峰，而在聯(lián)用DDP時(shí)更明顯，并與時(shí)間有明顯相關(guān)性（P＜0.05），見圖2。

3 討論

JAKs/STATs代表的是一條極其快速的從細(xì)胞外到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。胞漿中具有酪氨酸蛋白激酶活性的激酶（Just Another Kinase，JAK）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）在細(xì)胞內(nèi)與受體相結(jié)合，可完成從胞質(zhì)到核內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。STATs家族重要成員STAT3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常激活，目前被確認(rèn)為是癌基因[3]。AG490是酪氨酸激酶抑制劑，可以阻斷JAKs激酶激活，進(jìn)而抑制STAT3通路活化，但其復(fù)雜的信號(hào)通路遠(yuǎn)未完全明確。由于傳統(tǒng)的化療方案不能夠完全抑制或消滅卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]，因此AG490與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可能為卵巢癌的治療提供新的有效途徑。在本實(shí)驗(yàn)中，利用AG490來抑制JAK酶活性，并聯(lián)合順鉑觀察JAK酶被抑制后人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)凋亡的變化情況。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸，可以和酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位置，選擇性地阻斷JAK，從而阻斷JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。應(yīng)用AG490作用于骨髓瘤細(xì)胞系U266[5]，可通過抑制STAT3和DNA結(jié)合的活性來抑制STAT3活化與凋亡，具有抗腫瘤的作用。Burke等[6]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞系MAD-MB-468中，AG490可以抑制STAT3持續(xù)活化，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，但AG490不能誘導(dǎo)正常乳腺細(xì)胞凋亡。Huang等[7]發(fā)現(xiàn)，STAT3高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑及泰素均耐藥，應(yīng)用順鉑與AG490聯(lián)合作用于細(xì)胞系MDAH2774，可以抑制其STAT3通路活化，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。萬琪等[8]認(rèn)為AG490可以間接阻斷STAT3通路，使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對(duì)化療藥物的敏感性。以上這些證明AG490能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的毒性作用，有望成為腫瘤分子治療中的新藥物。

表2 AG490單用或與DDP聯(lián)合治療在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響（s，%）

表2 AG490單用或與DDP聯(lián)合治療在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響（s，%）

組別對(duì)照組AG490 50 μmol/L組AG490 100 μmol/L組AG490 50 μmol/L+DDP 1 μg/L組AG490 100 μmol/L+DDP 1 μg/L組48小時(shí)F P 12小時(shí)1.04±0.04 1.91±0.06 2.27±0.27 3.27±0.21 3.94±0.11 594.02＜0.05 24小時(shí)1.37±0.10 10.61±0.5 15.08±1.47 27.06±1.74 37.41±5.71 472.28＜0.05 4.38±0.60 25.56±3.44 43.08±3.36 55.40±4.19 69.08±3.62 161.73＜0.01

圖2 AG490單用或聯(lián)合DDP時(shí)SKOV3細(xì)胞的凋亡曲線

本實(shí)驗(yàn)用AG490單獨(dú)或與DDP聯(lián)合處理人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，這種抑制作用更加明顯。從24小時(shí)起，AG490+DDP組對(duì)腫瘤的抑制作用顯著強(qiáng)于任一單藥組，產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，且治療結(jié)束AG490+DDP組抑瘤率、凋亡率顯著高于AG490組（P＜0.05），說明AG490與DDP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用較為理想，AG490可以增強(qiáng)DDP的藥物敏感性，并能減輕順鉑的藥物反應(yīng)。同時(shí)流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，AG490阻斷STAT3通路，可使人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，表明AG490單用或與DDP聯(lián)合應(yīng)用，可在卵巢癌的治療中發(fā)揮有效、安全的抗腫瘤作用。

通過本研究結(jié)果可以推測(cè)，阻斷JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為卵巢癌的治療提供新的思路，AG490有希望用于卵巢癌治療，但細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，各條通路之間存在各種交互聯(lián)系，相互協(xié)同、相互制約，共同介導(dǎo)宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程。因此，還需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及大樣本、多中心臨床實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)，深入研究STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制，有可能為發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗卵巢癌藥物提供新的理論基礎(chǔ)。

[1]曹澤毅，宋鴻釗，嚴(yán)仁英，等.中華婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.

[2]孟智超，李淑玲，肖建英.大黃素抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和抑制Survivin及XIAP的蛋白表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34（9）：1254-1259.

[3]Garcia R，Bowman TL，Niu G，et al.Constitutive activation of Stat3 by the Src and JAK tyrosine kinases participates in growth regulation of human breast carcinoma cells[J].Oncogene，2001（20）：2499-2513.

[4]Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity up regulates VEGF expression and tumor angiogenesis[J].Oncogene，2002，21（13）：2000-2008.

[5]Bowman T，Garcia R，Turkson J，et al.STATs in oncogenesis[J].Oncogene，2000（21）：2474-2488.

[6]Burke WM，Jin X，Lin HJ，et al.Inhibition of constitutively active STAT3 suppresses growth of human ovarian and breast cancer cells[J].Oncogene，2001，20（55）：7925-7934.

[7]Huang M，Page C，Reynolds RK，et al.Constitutive activation of STAT3 oncogene product in human ovarian carcinoma cells[J].Gynecol Oncol，2000，79（1）：67-73.

[8]萬琪，褚艷俠，鄭艾，等.維拉帕米對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株增殖和遷移的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，42（1）：78-81.

R195

B

1671-1246（2017）08-0105-03

蘭州市科技局基金項(xiàng)目（2013-3-1）