孔祥瑞，楊軍，王讓劍

福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355000

茶樹葉片精準測色裝置構建及在稀有種質(zhì)鑒別中的應用

孔祥瑞，楊軍，王讓劍

福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355000

采用掃描儀、測色器ColorPix和RGB顏色系統(tǒng)建立測色裝置，并利用在線工具ColorHexa將色差指標值轉換成 CIELab顏色體系參數(shù)，對綠、黃、紫色系典型茶樹種質(zhì)進行環(huán)向和徑向測色法比較分析。結果表明，徑向測定法采用單葉多點重復取值與環(huán)向測定法中環(huán)位取值具有相近葉色表征作用。通過對120個不同葉色種質(zhì)的徑向多點位重復測定和環(huán)向中環(huán)位測定，2種方法的明度 L*、色差指標值 a*和 b*顯著正相關。但是，考慮到使用的簡便性與分析效率，提出用環(huán)向中環(huán)位測定值定義葉色更為合適。對上述 120個供試茶樹種質(zhì)的環(huán)向中環(huán)位葉色測定值構成的三維散點圖進行分析，發(fā)現(xiàn)能夠將紫紅色種質(zhì)與紫色系種質(zhì)有效分離，更進一步證明該技術在特異葉色種質(zhì)精準鑒別中具有實用價值。

茶樹；葉色；測色裝置；定量描述

茶樹作為葉用植物，葉色表型不僅與胞內(nèi)花青素、氨基酸等重要次生代謝產(chǎn)物的豐富程度直接或間接相關[1-4]，也是品種適制何種茶類的簡單評判依據(jù)[5-6]。所以，葉色定量描述是茶樹資源育種研究的重要組成部分。早期，陳亮等[7]以目測為主，將茶樹一芽二葉期的芽葉色澤描述規(guī)范為5個等級進行了統(tǒng)一，至今仍作為傳統(tǒng)表型分類方法加以利用。之后，隨著測色儀在茶樹葉色研究中廣泛使用，基于儀器測色途徑的分類系統(tǒng)略具雛形[8-9]。然而這些分類方法在解釋眾多茶樹葉色變異時仍存在一定的局限性。精細葉色定量描述方法的缺失，給依據(jù)葉色表型進行品種甄別和種質(zhì)精細劃分帶來了不便[10]。此外，對于特小葉面積和非均色化材料，依賴現(xiàn)有技術更無法實現(xiàn)葉色性狀的精準數(shù)量分類，一定程度上阻礙了遺傳標記等數(shù)量遺傳學技術在茶樹葉色表型性狀研究中的有效應用。

本文選取茶樹品種和種質(zhì)資源120個，使用掃描儀、測色器 ColorPix v1.2、RGB色彩系統(tǒng)構成的測色裝置，及在線色彩參數(shù)轉換工具ColorHexa，對供試材料進行基于環(huán)向和徑向 2種測色部位葉色表型精確數(shù)量分類的比較分析。同時，通過花色研究中常用的CIELab顏色體系[11]對測色結果進行評價，試圖建立一套高精度測色系統(tǒng)，以期為茶樹種質(zhì)分類中精確量化定義葉色表型和各類作物的葉類病害監(jiān)控[12-13]、營養(yǎng)監(jiān)測[14]等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所烏龍茶種質(zhì)資源圃，2016年春季選取進入一芽三葉期的茶樹種質(zhì)資源120個，共4個色系，其中綠色系40個材料為福鼎大白茶及福云系列群體種，黃色系40個材料為白雞冠和“白雞冠（♀）×黃觀音（♂）”雜交組合的BC1群體，紫色系為地方群體種，紫紅色系2個材料為自發(fā)突變枝條扦插植株。

1.2 葉色測定方法

依據(jù)楊如新等[9]的分析結果，選取芽下開展的第1葉作為測色材料，用明基掃描儀在軟驅 MiraScan 6.2 [7650 series(Q76)]中進行掃描，參數(shù)為彩色、1 200 dpi，掃描得到圖片在Photoshop CS3中打開，按“視圖-顯示-網(wǎng)格，編輯-首選項-參考線、網(wǎng)格、切片和記數(shù)”的步驟增加網(wǎng)格，以便統(tǒng)一后續(xù)測色部位。測色采用 RGB 色彩系統(tǒng)，用 ColorPix v1.2（www.colorschemer.com）進行參數(shù)采集，之后經(jīng)在線工具ColorHexa（http://www.colorhexa.com）將 RGB色彩系統(tǒng)參數(shù)轉換成 CIELab顏色系統(tǒng)參數(shù)，從而對測色結果進行評價。

測色部位的選擇有2種方法，一是徑向測定法，即由葉基向葉尖方向等距離取5個點進行測定，同時每個點橫向重復3次；另一種方法是環(huán)向測定法，即在葉面上由葉緣向葉片主脈方向（由外向內(nèi)）畫5個等距離的橢圓，每個橢圓上取4個頂點作為測色點，由葉基開始按逆時針方向測定，取均值后，每1圈代表1個測色部位，共獲得類似于第 1種方法的 5個數(shù)值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

用EXCEL2016對茶樹葉片不同測色部位與其明度之間進行線性回歸擬合及顯著性檢驗。應用 R3.3.0分析茶樹葉色明度和色差指標值的三維散點圖。

2 結果與分析

2.1 葉片徑向葉色變化

茶樹主要有綠、紫、黃三大色系，本文分別以福鼎大白茶、紫鵑、白雞冠代表3個色系進行葉色測定部位及測定方法的比較分析。

按徑向測定法測定福鼎大白茶第 1葉從葉基到葉尖5個點位的L*、a*、b*值（表1），對這些數(shù)據(jù)分別進行線性回歸擬合及顯著性檢驗，同時求得明度等各色差指標值之間的極差，并繪制測色點位與 L*值的線性回歸圖（圖1）。

對另外兩個品種進行如上相同分析，并將結果歸納入表1。由表1可知，徑向測定中只有紫鵑的a*值由葉基向葉尖與不同部位之間線性回歸擬合達顯著水平，其余各色差指標值在三大色系的代表性材料上均與測色部位之間線性擬合結果不達顯著水平，多呈現(xiàn)為與圖1類似的無規(guī)律分布。所以，就供試材料而言，徑向測定法不能選擇任何單一測色點位作為測定L*、a*、b*值的代表性部位。

此外，就單一色差指標值在不同色系中的差異來看，明度值L*在紫色系中差異最大，在黃色系中次之，在綠色系中最小。而a*、b*值雖然也表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，但其變幅卻相對較小。所以，茶樹葉片細胞內(nèi)的有色體分布可能存在非均一化特征，當采用徑向測定法測色時，應以多點位測定的均值作為測色數(shù)據(jù)。

表1 福鼎大白茶、白雞冠和紫鵑徑向測定不同部位葉色L*、a*、b*值Table 1 The value ofL*、a*、b*in different leaf positions of tea cultivars ‘Fuding dabachai’, ‘Baijiguan’, and ‘Zijuan’by radial direction method

圖1 基于徑向測定福鼎大白不同部位葉色明度變化趨勢Fig. 1 The tendency of brightness in the basal to tip leaves using radial direction method

2.2 葉片環(huán)向葉色變化

按環(huán)向測定法，仍對福鼎大白茶、紫鵑、白雞冠為代表的3個色系進行葉色色差指標值測定，所選葉片與徑向測定法的葉片一一對應。其中福鼎大白茶的明度值與由外而內(nèi)測色環(huán)位之間呈顯著線性相關（圖2）。用同樣的方法在另外兩個品種的環(huán)位和環(huán)向L*、a*、b*值之間建立線性回歸。不同環(huán)之間葉色極差與回歸顯著性水平檢驗結果歸納見表 2。由分析結果可知，紫葉種和綠葉種的L*值在不同環(huán)位之間極差較大，且2個色系均在L*值上線性回歸擬合達顯著水平（P＜0.05）。而黃葉種，L*值的極差相對較小，a*、b*值的極差卻在 3個色系中均為最大，但線性回歸不達顯著性水平。綜上所述，在線性關系中，葉色表型數(shù)量的中間環(huán)位值近似于各環(huán)位均值。因此，選擇中間環(huán)位測定L*、a*、b*值對茶樹葉色代表性更好。

2.3 徑向與環(huán)向法的葉色測定差異分析

為了深入比較兩種測色方法的精確性，對一芽三葉期的120個供試材料取芽下開展第1葉分別用徑向法測定15個隨機點位的L*、a*、b*均值和用環(huán)向測定法測定中間環(huán)位的L*、a*、b*值，并對兩種方法測得的L*、a*、b*值分別以徑向值為橫軸，以環(huán)向值為縱軸進行擬合，得到兩種方法測得L*、a*、b*值的二維散點圖，其中角平分線代表橫縱坐標值相等，角平分線下方為徑向值大于環(huán)向值，平分線以上為環(huán)向值大于徑向值。

圖2 基于環(huán)向測定福鼎大白茶不同部位葉色明度變化趨勢Fig. 2 The tendency of brightness in the basal to tip leaves using circular direction method

表2 福鼎大白茶，白雞冠和紫鵑環(huán)向測定不同部位葉色L*、a*、b*值Table 2 The value ofL*、a*、b*in different leaf positions of tea cultivars ‘Fuding dabai’, ‘Baijiguancha’, and ‘Zijuan’by circular direction method

由分析可知，L*、a*、b*值均對稱分布于回歸線兩側，3個值在兩種方法之間均表現(xiàn)出顯著正相關（圖3），說明徑向法當取色位點擴充到≥15個時，其測色均值與環(huán)向測定法的中間環(huán)位測色值具有相近的表征作用，但是較后者工作量大，會降低數(shù)據(jù)采集效率。

再對 120個供試材料用兩種不同方法測得的L*、a*、b*值進行匯總分析。由表3可知，徑向測定法測得的多點L*、a*均值，其變幅均略大于環(huán)向法取中環(huán)位測色對應數(shù)值，但變異系數(shù)近似相等，兩種方法之間L*變幅差值最大，為 4.81，而a*、b*變幅差值僅分別為0.41、－0.46。所以，兩種測定方法在定義和區(qū)分葉色方面具有相近的解析精度，其中徑向法只有L*值變幅較寬，在明度測定方面代表性略強，但該測定法工作量大，不便于大規(guī)模實驗中應用，而相比之下，環(huán)向法則更具優(yōu)勢。

圖3 茶樹徑、環(huán)法葉色L、a、b值的關系Fig. 3 The correlation between tea leafL*,a*,b*obtained by the radial and circular direction methods

表3 茶樹葉色徑、環(huán)法測定比較Table 3 Comparison of the leaf color values obtained by the radial and circular direction methods

2.4 應用于稀有葉色種質(zhì)鑒定

經(jīng)過對兩種測定法的比較分析之后，應用較為簡易的環(huán)向測定法，選取環(huán)中位對 120個供試材料的第1葉測色，將L*、a*、b*值用于葉色三維空間作圖（圖4），在三維空間中，不同葉色供試材料呈現(xiàn)出了成簇分布趨勢，而稀有葉色種質(zhì)呈現(xiàn)為明顯的離散點，并遠離葉色連續(xù)變化趨勢線。圖中的2個紅色離散點代表的品種是2個紫紅色特異茶樹新種質(zhì)，其葉片呈色上有別于紫色種紫鵑，是茶樹中少見的色種，作為育種親本或中間材料，有望培育出紫紅葉色茶樹新品種。

圖4 茶樹葉色稀少品種以離散點形式出現(xiàn)Fig. 4 The rare tea leaf colors appearing in outer dots

3 討論

3.1 茶樹葉色表型分析的測色裝置

在植物花、葉等測色研究中通常采用基于色空間（Color space）的儀器測色法，即利用色差儀在自帶特定光源條件下測量色差指標值[15]。但是由于測色儀鏡口與茶樹葉片大小之間的不對等性，使得在實際操作過程中會出現(xiàn)由于葉面積太小導致近似漏光、單葉多點重復測色難以實現(xiàn)等諸多不足。

使用掃描儀、ColorPix等組件構成的測色裝置，卻可以避免上述缺點，尤其是在將掃描圖片放入Photoshop中進行網(wǎng)格化處理之后，利用軟件的放大功能和 ColorPix的高靈敏度特性，在1 mm2的葉面積上幾乎可以實現(xiàn)＞300個點的無重復測色操作，這對于特異葉色或花斑葉色材料的鑒定，以及觀賞性植物的花色測定、果蔬類葉病監(jiān)測等均具有實際應用價值。

3.2 測色系統(tǒng)的選擇

植物花色研究中，對于色相表型的精確定量描述常采用CIELab顏色系統(tǒng)、孟塞爾顏色系統(tǒng)或 ISCC-NBS色名表示法[16]，其中CIELab顏色系統(tǒng)在現(xiàn)有研究中的應用較多[17-18]。劉東明等[19]用CIELab顏色系統(tǒng)，對茶樹綠色、黃綠、紫綠色系的L*、a*、b*值進行比較分析，認為CIELab顏色系統(tǒng)的色差指標值在不同葉色材料間具有一定的分布規(guī)律。楊如新等[9]用CIELab顏色系統(tǒng)結合分層聚類法對茶樹葉色進行表型數(shù)量化分析，成功地將常見茶樹葉色表型細分成了7個色系。而本研究中由于測色裝置本身限制，色差指標值采集選取的是馬鈴薯等作物已廣泛應用的RGB測色系統(tǒng)[20-21]，后續(xù)分析是通過在線工具ColorHexa，將其轉換成CIELab顏色系統(tǒng)對應色差指標值完成。由分析結果可知，即便是表型差異較小的紫色系與紫紅色系也可以通過本研究中采用的測色裝置及其處理方法加以鑒別，說明使用RGB測色系統(tǒng)的測色裝置及其配套分析方法與CIELab顏色系統(tǒng)一樣[22]，在茶樹葉色分類中具有完全相同的表征作用。

3.3 徑向與環(huán)向測色方法的比較

徑向測定與環(huán)向測定結果中L*、a*、b*值的顯著正相關和單值變幅區(qū)間高相似性，使得兩種方法在非花斑型葉色情況下可以相互代替。此外，本文環(huán)向測定法中的環(huán)位取點規(guī)則也適用于葉緣變色種質(zhì)按不同環(huán)位進行測色比較鑒定。但是，對于長期人工選育過程中出現(xiàn)的稀有花斑葉色種質(zhì)或品種則應以特例處理。

茶樹葉色測定的研究在于找到一種統(tǒng)一準確的測定規(guī)則，只有在嚴格限定發(fā)育時期的前提下，應用統(tǒng)一規(guī)則測定葉色，才能獲得可靠的茶樹葉色值，進而區(qū)分相近葉色，發(fā)現(xiàn)新種質(zhì)和原有品種葉色差異，便于比較不同地區(qū)茶樹種質(zhì)或品種，利于茶樹葉色研究交流，推動茶樹葉色研究發(fā)展。

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Establishment of Precise Color Measuring Device for Tea (Camellia sinesis L.) Leaf and Its Application in Identification of Rare Germplasm

KONG Xiangrui, YANG Jun, WANG Rangjian

Institute of Tea Reaearch, Fujian Academy of Agricultural Sciences/
Fujian Sub-Center of National Tea Improvement Center, Ministry of Agriculture, Fu′an 355000, Chnina

A tea leaf color measurement system was established by using the scanner, color picker tool ColorPix and RGB color rules. The value of color difference was converted into CIELab color system parameters by the online tool ColorHexa and then the leaf colors of Typical Green, Yellow and Purple tea Germplasms were comparative analyzed through circular direction and radial direction methods. The results showed that the single leaf multi - point repeat value in radial measurement and the mid-ring position value in circular method had similar leaf color characterization. The 120 tea germplasms were randomly selected and measured for the brightness L*and chromatic components a*and b*. The values of lightness L*and color difference a*and b*between the two methods were significantly and positively correlated. However, when the facilitation and the efficiency of analysis were taken into consideration, it is better to use the color value in the mid-ring position by circular direction method. When the leaf color values of 120 germplasms were measured in the mid-ring position to draw the three-dimensional scatter plots, the mauve color group was effectively separated from the purple germplasms, which further proved the efficiency of the method to accurately identify specific leaf color germplasm.

tea plant, leaf color, color measurement device, quantitative description

S571.1；S326

A

1000-369X（2017）02-160-07

2016-12-26

2017-02-06

福建省自然科學基金（2016J01118）、福建省省屬公益類科研院所專項（2015R1012-7）

孔祥瑞，助理研究員，主要從事資源育種方面的研究。E-mail: xiangruikong@bioxxx.cn